S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Inledning
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - orsakssubstansen för senblod, den ekonomiskt viktigaste sjukdomen för potatis och tomater - har uppmärksammats av forskare från olika länder i mer än ett och ett halvt sekel. Plötsligt uppträdde i Europa i mitten av XNUMX-talet orsakade det en potatisepidemi som har förblivit i minnet av många generationer.
Hittills kallas det ofta "den irländska hungersvampen". Nästan hundra år efter de första epidemierna upptäcktes vilda mexikanska potatisarter som är resistenta mot senblod, metoder för att korsa dem med odlad potatis utvecklades (Muller, 1935), och de första senbeständiga sorterna erhölls (Pushkarev 1937) Men snart efter starten av sin kommersiella odling ackumulerades raser av den sena kittpatogenen som var virulent mot resistenta sorter. och introduktionen av nya resistensgener från vilda mexikanska potatis i sorter började snabbt tappa effektiviteten.
Fel med användning av monogent (vertikalt) motstånd tvingade uppfödare att leta efter mer komplexa sätt att utnyttja ospecifikt polygeniskt (horisontellt) motstånd. Under de senaste åren har mycket aggressiva raser börjat ackumuleras i enskilda parasitpopulationer, vilket orsakar erosion av till och med icke-specifikt motstånd. Tillkomsten av fungicidresistenta stammar har orsakat problem i användningen av potatisskyddskemikalier.
På grund av de betydande skillnaderna mellan oomycetes och svampar i kemisk sammansättning, ultrastruktur och metabolism är fungicider, särskilt systemiska, som används för att skydda växter från många svampsjukdomar, ineffektiva mot oomycetes.
Därför användes sprutning med kontaktpreparat med ett brett verkningsspektrum vid kemiskt skydd mot senblåsning (upp till 12 gånger per säsong eller mer). Ett revolutionerande steg var användningen av fenylamider, som är giftiga för oomycetes och sprids systemiskt i växter. Men deras omfattande användning ledde snabbt till ackumulering av resistenta stammar i svamppopulationer (Davidse et al., 1981), vilket väsentligt komplicerade växtskyddet. P. infestans är praktiskt taget den enda parasiten i den tempererade zonen, vars skada inom ekologiskt jordbruk inte kan neutraliseras utan användning av kemiska skyddsmedel (Van Bruggen, 1995).
Ovanstående förklarar den enorma uppmärksamhet som forskare från olika länder lägger på studien av P. infestans-populationer, dynamiken i deras överflöd och genetiska sammansättning, liksom de genetiska variationerna.
Livscykel för R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans utvecklar ett intercellulärt mycelium med haustoria inuti potatisblad. När man matar på vävnaderna i bladet orsakar det mörka fläckar som blir svarta och ruttnar i vått väder. Med ett starkt nederlag dör hela bladet. Efter en period av utfodring bildas utväxter på myceliet - sporangioforer - som växer utåt genom munnen. Vid vått väder bildar de en vit blomning runt fläckarna på bladens undersida. I ändarna av sporangioforerna bildas citronformad zoosporangia som bryts av och bärs av regnspray (fig 1). Faller i vattendroppar på ytan av ett potatisblad, sporangia gror med 6-8 zoosporer, som efter en rörelseperiod är rundade, täckta med ett skal och groddar med ett groddrör. Spiren tränger igenom stomatan in i bladvävnaden. Under vissa förhållanden kan sporangier växa i ett tillväxtrör direkt i bladvävnad. Under gynnsamma förhållanden är tiden från infektion till bildandet av ny sporulering bara 3-4 dagar.
En gång på marken och filtreras genom jorden kan sporangia infektera knölar. Allvarligt drabbade knölar ruttnar under lagring; i svagt drabbade kan infektionen bestå fram till nästa säsong. Dessutom kan orsakssubstansen för senblåsan kvarstå på vintern i form av oosporer (tjockväggiga vilande sexuella sporer) i jorden på växtrester och på tomatfrön. Oosporer bildas på levande växtorgan när stammar av olika parningstyper möter överdriven fukt. På våren bildas aseksuell sporulering på planterade infekterade knölar och på växtrester med oosporer; zoosporer kommer in i jorden och orsakar infektion i nedre blad av växter. I vissa fall kan mycelium växa från den infekterade knölen längs den gröna delen av växten och visas vanligtvis i den övre delen av stammen.
En signifikant skillnad mellan oomycetes och de flesta svampar ligger i övervägande av diplofas i deras livscykel med gametisk meios och grobarhet av zygoter (oosporer) utan reduktiv kärnklyvning. Denna funktion, plus dipolär heterotallism, som ersätter bisexualitet, verkar göra det möjligt att tillämpa på oomycetes de metoder som utvecklats för att studera populationer av högre eukaryoter (analys av panmixia och indelning av populationer, intra- och interpopulation genflöden, etc.). Tre faktorer tillåter dock inte fullständig överföring av dessa tillvägagångssätt i studien av P. infestans-populationer.
1. Tillsammans med hybridoosporer bildas självfertila och parthenogenetiska oosporer i populationer (Fife och Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), och frekvensen av deras bildning kan vara tillräcklig för att påverka på testresultaten.
2. Den sexuella processen i P. infestans ger ett obetydligt bidrag till dynamiken i befolkningsstorleken, eftersom svampen reproducerar huvudsakligen av vegetativa sporer och bildar mer än 90% av resultaten av analysen av parningstypen enligt den traditionella metoden på ett näringsmedium ... växtsäsongen är flera generationer av asexuell sporulation (polycyklisk sjukdomsutveckling). Oosporer spelar en viktig roll i bevarandet av organismen under den period då det inte finns några gröna växter (på vintern) och i den primära infektionen av plantor. Sedan, under sommaren, inträffar klonal reproduktion och en ökning eller omvänt en minskning av antalet enskilda kloner som uppstår som ett resultat av sexuell rekombination, vilket huvudsakligen bestäms av valet av de mer anpassade. Därför kan förhållandet mellan enskilda kloner i en population i början och slutet av epifytotika vara helt annorlunda.
3. Den beskrivna cykeln är karakteristisk för de infödda populationerna av P. infestans i deras hemland, Centralamerika. I andra delar av världen var den sexuella processen inte känd på mer än 100 år; det vegetativa mycelet i infekterade potatisknölar var övervintringsstadiet. Livscykeln var helt agamisk och spridningen var i fokus: infektionen från enstaka infekterade planterade knölar passerade till bladen och bildade primära foci för sjukdomen, som kunde smälta samman under den massiva utvecklingen av sjukdomen.
Således kan det i vissa regioner förekomma en växling mellan sexuella och asexuella cykler, medan i andra - endast asexuella cykler.
Ursprung för P. INFESTANS
P. infestans uppträdde i Europa i slutet av 1991-talets första hälft. Eftersom potatisen är infödd i nordöstra Sydamerika, antogs att parasiten fördes därifrån till Europa under den chilenska salpeterns boom. Studier som utförts vid Rockefeller Center potatisstation i Toluca Valley i Mexiko tvingade emellertid denna uppfattning att revideras (Niederhauser 1993, XNUMX).
1. I Tolucadalen har lokala tuberösa potatisarter (Solanum demissum, S. bulbocastanum, etc.) olika uppsättningar gener för vertikal resistens i kombination med en hög nivå av ospecifik resistens, vilket indikerar en lång samutveckling med parasiten. Sydamerikanska arter, inklusive potatisgrödor, saknar resistensgener.
2. I Tolucadalen finns isolat med parningstyperna A1 och A2, varigenom den blandade populationen av P. infestans är utbredd; medan i hemlandet för den odlade potatisen, Sydamerika, sprider sig parasiten klonalt.
3. I Tolucadalen finns det årliga svåra epidemier med sena rötter. Därför, bland nordamerikanska forskare (Cornell University), är åsikten om Mesoamerica (Centralamerika) som födelseplats för potatisfytofthora etablerad (Goodwin et al., 1994).
Sydamerikanska forskare delar inte denna åsikt. De tror att den odlade potatisen och dess parasit P. infestans har ett gemensamt hemland - de sydamerikanska Anderna. De stödde sin ståndpunkt genom molekylära studier om analysen av DNA-polymorfier i mitokondriellt genom (mtDNA) och kärngener RAS och β-tubulin (Gomez-Alpizar et al., 2007). De visade att stammarna som samlats in från olika delar av världen härstammade från tre avvikande förfäderslinjer som (alla tre) finns i de sydamerikanska Anderna. Andinska haplotyper är ättlingar till två rader: isolat av den äldsta mtDNA-släkten finns på vildväxande Solanaceae från avsnittet Anarrhicomenum i Ecuador, medan isolat av andra raden är vanligt på potatis, tomater och vilda nattskuggor. I Toluca härstammar till och med sällsynta haplotyper från endast en härstamning, med den genetiska variabiliteten hos Toluca-stammarna (låg allelfrekvens för vissa variabla platser) indikerar en stark grundareeffekt på grund av den senaste driften.
Dessutom hittades en ny art P. andina i Anderna, morfologiskt och genetiskt lik P. infestans, vilket enligt författarna pekar på Anderna som en het plats för speciering i släktet Phytophthora. Slutligen, i Europa och USA, inkluderar P. infestans befolkningar båda andinska släkter, medan i Toluca bara en.
Denna publikation föranledde ett svar från en grupp forskare från olika länder, som gjorde mycket experimentellt arbete för att revidera den tidigare utförda studien (Goss et al., 2014). I detta arbete användes först mer informativa mikrosatellit-DNA-sekvenser för att studera DNA-polymorfismer; för det andra, för analys av klustring, migrationsvägar, tid för skillnader mellan befolkningar etc. mer avancerade modeller användes (F-statistik, Bayesian-approximationer, etc.) och för det tredje användes en jämförelse inte bara med den andinska arten P. andina, där en hybridnatur etablerades (P. infestans x Phytophthora sp.) , men också med den mexikanska endemiska arten P. mirabilis, P. Ipomoeae och Phytophthora phaseoli - genetiskt nära P. infestans som tillhör samma klade (Kroon et al., 2012). Som ett resultat av dessa analyser visade det sig otvetydigt att rotdelen av det fylogenetiska trädet av alla arter av släktet Phytophthora som togs med i studien, förutom hybriden P. andina, tillhör mexikanska stammar och migrationsflödet har riktningen Mexiko - Andes, och inte tvärtom, och dess början sammanfaller med den europeiska kolonisering av den nya världen (för 300-600 år sedan). Således inträffade uppkomsten av P. infestans-arter specialiserade för nederlag av potatis i det sekundära genetiska centrumet för bildandet av tuberösa solanaceous växter, dvs. i Centralamerika.
Genomet av P. INFESTANS
År 2009 sekvenserade ett internationellt forskargrupp det fullständiga P infestans-genomet (Haas et al, 2009), vars storlek var 240 MB. Detta är flera gånger mer än hos närbesläktade arter P. sojae (95 Mb), vilket orsakar rotröta av sojabönor och P. Ramorum (65 Mb), vilket påverkar sådana värdefulla trädarter som ek, bok och några andra. De erhållna uppgifterna visade att genomet innehåller ett stort antal kopior av upprepade sekvenser - 74%. Genomet innehåller 17797 proteinkodande gener, varav huvuddelen är gener involverade i cellulära processer, inklusive DNA-replikering, transkription och translation av proteiner.
En jämförelse av genomet från släktet Phytophthora avslöjade en ovanlig organisation av genomet, bestående av block av sekvenser av konserverade gener, i vilka gendensiteten är relativt hög och innehållet av upprepade sekvenser är relativt lågt, och enskilda regioner med icke-konserverade gensekvenser, med låg gendensitet och högt innehåll av upprepande regioner. Konservativa block står för 70% (12440) av alla P. infestans proteinkodande gener. Inom konservativa block är gener vanligtvis nära varandra med ett genomsnittligt intergeniskt avstånd på 604 bp. I områden mellan konservativa block är det intergeniska avståndet större (3700 bp) på grund av en ökning av densiteten hos upprepande element. Snabbt utvecklande effektor-sekretoriska gener finns i genfattiga regioner.
Sekvensanalys av P. Infestans-genomet visade att ungefär en tredjedel av genomet tillhör transponerbara element. P. infestans-genomet innehåller signifikant fler olika transposoneringsfamiljer än andra kända genom. De flesta av P. infestans transposoner tillhör zigenarefamiljen.
Ett stort antal specifika genfamiljer som är involverade i patogenes har identifierats i P. infestans-genomet. En betydande del av dem kodar för effektorproteiner som förändrar värdplantans fysiologi och bidrar till dess infektion. De faller i två breda kategorier: apoplastiska effektorer, som verkar i de intercellulära utrymmena (apoplaster) och cytoplasmatiska effektorer, som kommer in i celler via haustoria. Apoplastiska effektorer inkluderar utsöndrade hydrolytiska enzymer såsom proteaser, lipaser och glykosylaser som förstör växtceller; hämmare av värdväxtens enzymer och nekrotiserande toxiner såsom Nep1-liknande proteiner (NPL) och Pcf-liknande små cysteinrika proteiner (SCR).
P. infestans effektorgener är många och vanligtvis större än icke-patogena gener. De mest kända är de cytoplasmatiska effektorerna RXLR och Crinkler (CNR). De typiska cytoplasmatiska effektorerna av oomycetes är RXLR-proteiner. Alla hittills upptäckta RXLR-effektorgener innehåller den aminoterminala gruppen Arg-XLeu-Arg, där X är en aminosyra. Som ett resultat av studien föreslogs att det finns 563 RXLR-gener i P. infestans-genomet, vilket är 60% mer än i P. sojae och P. ramorum. Cirka hälften av RXLR-generna i P. infestans-genomet är artsspecifikt. RXLR-effektorer har ett stort antal sekvenser. Bland dem identifierades en stor och 150 små familjer. Till skillnad från huvudproteomen är RXLR-effektorgenerna vanligtvis lokaliserade i genfattiga och upprepningsrika regioner i genomet. De mobila elementen som bestämmer dynamiken i dessa regioner främjar rekombination i dessa gener.
Cytoplasmatiska CRN-effektorer identifierades ursprungligen i P. infestans-transkript som kodar peptid för vävnadsnekros. Sedan deras upptäckt har lite varit känt om familjen till dessa effektorer. Analys av P. Infestans-genomet avslöjade en enorm familj av 196 CRN-gener, som är mycket större än P. sojae (100 CRN) och P. ramorum (19 CRN). Liksom RXLR är CRN modulära proteiner och består av en mycket konserverad N-terminal LFLAK-domän (50 aminosyror) och en angränsande DWL-domän som innehåller olika gener. De flesta CRN (60%) har en signalpeptid.
Möjligheten för olika CRN: er att störa värdprocessens cellulära processer har studerats. I analysen av växtnekros gjorde avlägsnandet av CRN2-proteiner det möjligt att identifiera den C-terminala regionen bestående av 234 aminosyror (position 173-407, DXG-domän) och orsaka celldöd. Analys av P. infestans CRN-gener avslöjade fyra olika C-terminala regioner, vilket också orsakar celldöd i växten. Dessa inkluderar de nyligen identifierade DC-domänerna (P. Infestans har 18 gener och 49 pseudogener), liksom D2 (14 och 43) och DBF (2 och 1) -domäner som liknar proteinkinaser. Proteiner från CRN-domäner uttryckta i en växt konserveras (i frånvaro av signalpeptider) i en växtcell och stimulerar celldöd genom en intracellulär mekanism. Ytterligare 255 sekvenser som innehåller CRN-domäner fungerar sannolikt inte som gener.
Ökningen av antalet och storleken för RXLR- och CRN-effektorgenfamiljer berodde antagligen på icke-allelisk homolog rekombination och genduplicering. Trots det faktum att genomet innehåller ett stort antal aktiva mobila element, finns det fortfarande inga direkta bevis för överföring av effektorgener.
Metoder som används i studien av befolkningsstruktur
Studien av populationernas genetiska struktur bygger för närvarande på analysen av rena kulturer av dess beståndsdelar. Analys av populationer utan att isolera rena grödor utförs också för specifika ändamål, till exempel för att studera aggressiviteten hos en population eller förekomsten av stammar som är resistenta mot fungicider i den (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Denna typ av forskning innefattar användning av speciella metoder, vars beskrivning ligger utanför denna översikts räckvidd. För den jämförande analysen av stammar används ett antal metoder, baserade både på analysen av DNA-strukturen och på studien av fenotypiska manifestationer. Jämförande analys av populationer måste hantera ett stort antal isolat, vilket ställer vissa krav på de metoder som används. Helst bör de uppfylla följande krav (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- vara billiga, enkla att implementera, inte kräva betydande tidskostnader, baseras på allmänt tillgänglig teknik (till exempel PCR);
- måste generera ett tillräckligt stort antal oberoende kodominant markörfunktioner;
- har hög reproducerbarhet;
- använda den minsta mängd vävnad som ska undersökas;
- vara specifika för substratet (den förorening som finns i kulturen bör inte påverka resultaten);
- behöver inte använda farliga procedurer och mycket giftiga kemikalier.
Tyvärr finns det inga metoder som motsvarar alla ovanstående parametrar. För en jämförande studie av stammar i vår tid används metoder baserade på analysen av fenotypiska egenskaper: virulens mot potatis- och tomatvarianter (potatis- och tomatlopp), parningstyp, spektra av peptidas-isoenzymer och glukos-6-fosfatisomeras och på analys av DNA-struktur: längdpolymorfism restriktionsfragment (RFLP), som vanligtvis kompletteras med en hybridiseringsprob RG 57, analys av mikrosatellitupprepningar (SSR och InterSSR), amplifiering med slumpmässiga primers (RAPD), amplifiering av restriktionsfragment (AFLP), amplifiering med primrar som är homologa med sekvenserna av mobila element (till exempel Inter SINE PCR), bestämning av mitokondriella DNA-haplotyper.
Korta beskrivningar av metoderna för jämförande studier av stammar som används i arbetet med P. Infestans
Fenotypiska markördrag
"Potatis" -lopp
"Potatis" -lopp är en vanlig undersökt och använd markör. "Enkel potatis" -lopp har en gen för potatisvirulens, "komplexa" - minst två. Black et al. (1953), som sammanfattar alla tillgängliga data, fann att phytophthora-rasen kan infektera växter med resistensgenen / generna som motsvarar P. infestans virulensgener / gener, och fann ras 1, 2, 3 och 4 som infekterar växter med generna R1, R2, R3 respektive R4, dvs. interaktionen mellan parasiten och värden sker enligt genen för genprincipen. Vidare upptäckte Black med deltagande av Gallegly och Malcolmson motståndsgenerna R5, R6, R7, R8, R9, R10 och R11, liksom motsvarande raser (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Det finns en omfattande mängd data om rasens sammansättning av patogenen från olika regioner. Utan att analysera dessa data i detalj kommer vi bara att indikera en allmän trend: där sorter med nya resistensgener eller deras kombinationer användes, först uppstod en viss försvagning av senblod, men sedan uppstod raser med motsvarande virulensgener och valdes ut och utbrott av senblod återupptogs. Specifik virulens mot de första 4 resistensgenerna (R1-R4) observerades sällan i de samlingar som samlades innan introduktionen i odling av sorter med dessa gener, men antalet virulenta stammar ökade kraftigt när patogenen parasiterade på sorter som bar dessa gener. Gener 5-11 var å andra sidan ganska vanliga i samlingar (Shaw, 1991).
En studie av förhållandet mellan olika raser under växtsäsongen, genomförd i slutet av 1980-talet, visade att i början av sjukdomsutvecklingen dominerade kloner med låg aggressivitet och 1-2 virulensgener i befolkningen.
Vidare minskar koncentrationen av de ursprungliga klonerna med utvecklingen av senblod och antalet "komplexa" raser med hög aggressivitet ökar. Förekomsten av den senare i slutet av säsongen når 100%. Vid förvaring av knölar minskar aggressiviteten och förlusten av individuella virulensgener. Klonersättningens dynamik kan förekomma i olika sorter på olika sätt (Rybakova & Dyakov, 1990). Våra studier 2000-2010 visade emellertid att komplexa raser hittades från början av epifytotika bland stammar isolerade från både potatis och tomater. Detta beror troligen på en förändring i befolkningen av P. Infestans i Ryssland.
1988-1995 nådde förekomsten av "superraces" med alla eller nästan alla virulensgener i olika regioner 70-100%. En sådan situation noterades till exempel i Vitryssland, i Leningrad, Moskva-regionerna, i Nordossetien och i Tyskland (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
"Tomat" tävlar
I tomatkulturer hittades endast 2 gener av resistens mot senblod - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) och Ph2 (Al-Kherb, 1988). Som i fallet med potatislopp sker interaktionen mellan tomater och P. infestans gen-för-gen-basis. T0-rasen infekterar sorter som inte har resistensgener (de flesta av de industriellt använda sorterna), T1-rasen infekterar sorter med Ph1-genen (Ottawa), och T2-rasen infekterar sorter med Ph2-genen.
I Ryssland hittades nästan uteslutande T0 på potatis; T0 rådde på tomater i början av säsongen, men senare ersattes den av T1-loppet (Dyakov et al., 1975, 1994). Efter 2000 började T1 på potatis i många populationer inträffa i början av epifytotiden. I USA var potatisstammar inte patogena för tomat, liksom raserna T0, T1 och T2, medan T1 och T2 dominerade på tomater (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Parningstyp
För att genomföra studien krävs testning (referens) stammar med kända parningstyper - A1 och A2. Testisolatet ympas med dem parvis i petriskålar med havregryn. Efter inkubering i 10 dagar undersöks plattorna med avseende på närvaro eller frånvaro av oosporer i mediet i stammarnas kontaktzon. Det finns fyra alternativ: stammen tillhör A4-parningstypen, om den bildar oosporer med A1-testaren, till A2, om den bildar oosporer med A2-testaren, till A1A1, om den bildar oosporer med båda testarna, eller är steril (2), om den inte bildar oosporer utan testare (de två sista grupperna är sällsynta).
För att snabbare bestämma typerna av parning försökte man identifiera regioner i genomet som är associerade med typen av parning, i syfte att ytterligare använda dem för att bestämma typen av parning med PCR. Ett av de första framgångsrika experimenten för att identifiera en sådan plats utfördes av amerikanska forskare (Judelson et al., 1995). Med hjälp av RAPD-metoden kunde de identifiera W16-regionen associerad med parningstyp i avkomman till de två korsade isolaten och utforma ett par 24-bp-primers för att förstärka det (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') och W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Efter restriktion av PCR-produkten med restriktionsenzym HaeIII var det möjligt att separera isolat med parningstyperna A1 och A2.
Ett annat försök att få PCR-markörer för att bestämma vilka typer av parning utfördes av koreanska forskare (Kim, Lee, 2002). De identifierade specifika produkter med AFLP-metoden. Som ett resultat utvecklades ett par primers PHYB-1 (framåt) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') och PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), vilket möjliggjorde selektiv förstärkning av genomregionen associerad med A2-parningstypen. Därefter fortsatte de detta arbete och designade primers 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, framåt) och 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), vilket möjliggör selektiv förstärkning av Mat-A1-regionen, karakteristisk för stammar med parningstyp A1. Användningen av PCR-diagnostik av parningstyper visade bra resultat när man studerade populationer av P. infestans i Tjeckien (Mazakova et al., 2006), Tunisien (Jmour, Hamada, 2006) och andra regioner. I vårt laboratorium (Mytsa, Elansky, opublicerat) analyserades 34 P. infestans-stammar isolerade från sjuka potatis- och tomatorgan i olika regioner i Ryssland (Kostroma, Ryazan, Astrakhan och Moskva). Resultaten av PCR-analys med användning av specifika primers mer än 90% sammanföll med resultaten av analysen av parningstypen enligt den traditionella metoden på ett näringsmedium.
Tabell 1. Variabilitet hos resistens inom Sib 1-klonen (Elansky et al., 2001)
Exempel på samlingsplats | Antal analyserade isolat | Antal känsliga (S), svagt resistenta (SR) och resistenta (R) stammar, st (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekaterinburg stad | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omsk-regionen | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaxylresistens som populationsmarkör
I början av 1980-talet noterades kraftiga utbrott av senblod orsakad av metalaxylresistenta P. infestans-stammar i olika regioner. Potatisodlingar i många länder har lidit betydande förluster (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Sedan dess har i många länder i världen kontinuerlig övervakning av förekomsten av fenylamidresistenta stammar i P. infestans-populationer genomförts. Förutom en praktisk bedömning av utsikterna för användning av fenylamidinnehållande läkemedel, byggande av ett system för skyddsåtgärder och förutsägelse av epytofotier har resistens mot dessa läkemedel blivit en av markörfunktionerna som används i stor utsträckning för jämförande analys av populationer av denna patogen. Användningen av resistens mot metalaxyl i jämförande populationsstudier bör dock utföras med hänsyn till det faktum att: 1 - den genetiska grunden för resistens ännu inte har bestämts exakt, 2 - resistens mot metalaxyl är ett selektivt beroende drag som kan variera beroende på användning av fenylamider, 3 - olika graden av känslighet för metalaxylstammar inom en klonal linje (tabell 1).
Spektra av isozymer
Isozymmarkörer är vanligtvis oberoende av yttre förhållanden, visar mendelsk arv och är kodominanta, vilket gör det möjligt att skilja mellan homo- och heterozygoter. Användningen av proteiner som genmarkörer gör det möjligt att identifiera både stora omorganisationer av det genetiska materialet, inklusive kromosomala och genomiska mutationer, och enstaka aminosyrasubstitutioner.
Elektroforetiska studier av proteiner har visat att de flesta enzymer finns i organismer i form av flera fraktioner som skiljer sig åt i elektroforetisk rörlighet. Dessa fraktioner är resultatet av kodning av flera former av enzymer av olika loci (isozymer eller isozymer) eller av olika alleler av samma lokus (allozymer eller alloenzymer). Det vill säga isozymer är olika former av ett enzym. Olika former har samma katalytiska aktivitet, men skiljer sig något i enstaka aminosyrasubstitutioner i peptiden och i laddning. Sådana skillnader avslöjas under elektrofores.
I studien av P. infestans-stammar används spektrum av isoenzymer av två proteiner, peptidas och glukos-6-fosfatisomeras, (detta enzym är monomorf i ryska populationer, därför presenteras inte metoder för dess studie i detta arbete). För att separera dem till isozymer i ett elektriskt fält appliceras proteinpreparat isolerade från de studerade organismerna på en gelplatta placerad i ett elektriskt fält. Diffusionshastigheten för enskilda proteiner i gelén beror på laddningen och molekylvikten. Därför separeras blandningen av proteiner i separata fraktioner i ett elektriskt fält som kan visualiseras med hjälp av speciella färgämnen.
Studien av peptidas-isoenzymer utförs på geléer av cellulosaacetat, stärkelse eller polyakrylamid. Det mest praktiska är metoden baserad på användningen av cellulosaacetatgeler tillverkade av Helena Laboratories Inc. Det kräver inte stora mängder testmaterial, det gör att man kan få kontrasterande band på gelén efter elektrofores för båda enzymlokerna, dess implementering kräver inte stora tids- och materialkostnader (fig. 2).
En liten bit mycel överförs till en 1,5 ml mikrorör, 1-2 droppar destillerat vatten tillsätts till den. Därefter homogeniseras provet (till exempel med en elektrisk borr med en plastfäste som är lämplig för ett mikrorör) och sedimenteras i 25 sekunder på en centrifug vid 13000 rpm. 8 pl från varje mikrorör. supernatanten överförs till applikatorplattan.
Cellulosaacetatgeln avlägsnas från buffertbehållaren, torkas mellan två ark filterpapper och placeras med arbetsskiktet uppåt på applikatorns plastbas. Lösningen från plattan överförs av applikatorn till gelén 2-4 gånger. Gelén överförs till en elektroforeskammare,
Tabell 2. Sammansättningen av lösningen som används för färgning av cellulosaacetatgel vid analysen av peptidas-isoenzymer, en droppe färg (bromfenolblå) placeras på kanten av gelén.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidas, 1000 U / ml 5 droppar
o-dianisidin, 4 mg / ml 8 droppar
MgCl2, 20 mg / ml 2 droppar
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 droppar
L-aminosyraoxidas, 20 u / ml 2 droppar
Elektrofores utförs i 20 minuter. vid 200 V. Efter elektrofores överförs gelén till ett målningsbord och färgas med en speciell målningslösning (tabell 2). 10 ml 1,6% DIFCO-agar smälts preliminärt i en mikrovågsugn, kyls till 60 ° C, varefter 2 ml agar blandas med en färgblandning och hälls på en gel. Ränder visas inom 15-20 minuter. L-aminosyraoxidasreagenset tillsätts omedelbart innan lösningen blandas med smält agar.
I ryska populationer representeras Pep 1-locus av genotyper 100/100 och 92/100. Homozygote 92/92 är extremt sällsynt (cirka 0,1%). Locus Rehr 2 representeras av tre genotyper 100/100, 100/112 och 112/112, och alla 3 varianterna är ganska vanliga (Elanky och Smirnov, 2003, fig. 2).
Genomforskning
Restriktionsfragmentlängdspolymorfism med efterföljande hybridisering (RFLP-RG 57)
Det totala DNA: t behandlas med EcoRI-restriktionsenzym, DNA-fragmenten separeras genom elektrofores i agarosgel. Kärn-DNA är mycket stort och har många repetitiva sekvenser, vilket gör det svårt att direkt analysera de många fragment som erhålls genom inverkan av restriktionsenzymer. Därför överförs DNA-fragmenten som separeras i gelén till ett speciellt membran och används för hybridisering med RG 1-sonden, som inkluderar nukleotider märkta med radioaktiva eller fluorescerande märkningar. Denna sond hybridiserar med repetitiva genomiska sekvenser (Goodwin et al., 57, Forbes et al., 1992). Efter visualisering av hybridiseringsresultaten på ett lätt- eller radioaktivt material erhålls en hybridiseringsprofil med flera locus (fingeravtryck), representerad av 1998-25 fragment (Forbes et al., 29). Sexuella (klonala) avkommor kommer att ha samma profiler. Genom arrangemanget av banden på elektroforetogramet bedöms likheterna och skillnaderna hos de jämförda organismerna.
Mitokondriella DNA-haplotyper
I de flesta eukaryota celler presenteras mtDNA i form av en dubbelsträngad cirkulär DNA-molekyl, som, till skillnad från kärnkromosomerna i eukaryota celler, replikeras semi-konservativt och inte är associerad med proteinmolekyler.
P. infestans mitokondriella genom sekvenserades, och ett antal verk ägnas åt analysen av restriktionsfragmentlängder (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Efter att Griffith och Shaw (1998) utvecklat en enkel och snabb metod för att bestämma mtDNA-haplotyper, blev denna markör en av de mest populära i P. Infestans-studier. Essensen av metoden består i sekventiell amplifiering av två mitokondriella DNA-fragment (från det gemensamma genomet) med primers F2-R2 och F4-R4 (tabell 3) och deras efterföljande restriktion med restriktionsenzymer MspI (första fragmentet) och EcoR1 (andra fragmentet). Metoden låter dig identifiera 1 haplotyper: Ia, IIa, Ib, IIb. Typ II skiljer sig från typ I genom närvaron av en 2 bp-insats och en annan plats för restriktionsställen i P4- och P1881-regionerna (Fig. 2).
Sedan 1996, bland de stammar som samlats på Rysslands territorium, noterades endast haplotyperna Ia och IIa (Elansky et al., 2001, 2015). De kan identifieras efter separation av restriktionsprodukterna med primer F2-R2 i ett elektriskt fält (fig. 4, 5). Typer av mtDNA används i den jämförande analysen av stammar och populationer. I ett antal arbeten användes typer av mitokondriellt DNA för att isolera klonala linjer och passera P. infestans-isolat (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Med PCR-RFLP-metoden drogs slutsatsen att mtDNA är heterogent i samma P. infestans-stam (Elansky och Milyutina, 2007). Förstärkningsförhållanden: 1x (500 sek. 94 ° C), 40x (30 sek. 90 ° C, 30 sek. 52 ° C, 90 sek. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reaktionsblandning: (20 | il): 0,2 U Taq DNA-polymeras, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq-buffert, 0,2 mM vardera dNTP, 30 pM primer och 5 ng av det analyserade DNA: t, avjoniserat vatten - upp till 20 | il.
Begränsning av PCR-produkten utförs i 4-6 timmar vid en temperatur av 37 ° C. Restriktionsblandning (20 | il): 10x MspI (2 | il), 10x restriktionsbuffert (2 | il), avjoniserat vatten (6 | il), PCR-produkt (10 | il).
Tabell 3. Primers som används för amplifiering av mtDNA polymorfa regioner
Ställe | primer | Primerlängd och placering | PCR-produktlängd | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Random primer amplification (RAPD)
Vid utförande av RAPD används en primer (ibland flera primers samtidigt) med en godtycklig nukleotidsekvens, vanligtvis 10 nukleotider i längd, med högt innehåll (från 50%) GC-nukleotider och låg glödgningstemperatur (cirka 35 ° C). Sådana primers "landar" på många komplementära platser i genomet. Efter förstärkning erhålls ett stort antal amplikoner. Deras antal beror på den eller de primer som används och reaktionsbetingelserna (MgCl2-koncentration och glödgningstemperatur).
Visualisering av amplikoner utförs genom destillation i polyakrylamid eller agarosgel. När du utför RAPD-analys är det nödvändigt att noggrant övervaka renheten hos det analyserade materialet, eftersom kontaminering med andra levande föremål kan orsaka en signifikant ökning av antalet artefakter, som är ganska många även vid analys av rent material (Perez et al, 1998). Användningen av denna metod i studien av P. infestans genomet återspeglas i många verk (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Valet av reaktionsbetingelser och primers (51 10-nukleotidprimers studerades) ges i artikeln av Abu-El Samen et al., (2003).
Microsatellite Repeat Analysis (SSR)
Mikrosatellitupprepningar (enkla sekvensrepetitioner, SSR) är tandemupprepande korta sekvenser av 1-3 (ibland upp till 6) nukleotider som finns i kärngenomen hos alla eukaryoter. Antalet på varandra följande upprepningar kan variera från 10 till 100. Microsatellite loci förekommer med en ganska hög frekvens och är mer eller mindre jämnt fördelade genom genomet (Lagercrantz et al., 1993). Polymorfism av mikrosatellitsekvenser är associerad med skillnader i antalet upprepningar av det grundläggande motivet. Mikrosatellitmarkörer är kodominanta, vilket gör det möjligt att använda dem för att analysera befolkningsstrukturen, bestämma släktskap, migrationsvägar för genotyp, etc. Bland andra fördelar med dessa markörer bör man notera deras höga polymorfism, god reproducerbarhet, neutralitet och förmågan att utföra automatisk analys och utvärdering. Analys av polymorfism av mikrosatellitupprepningar utförs genom PCR-förstärkning med primers som kompletterar unika sekvenser som flankerar mikrosatellit loci. Initialt utfördes analysen med separering av reaktionsprodukterna på en polyakrylamidgel. Senare föreslog anställda vid företaget Applied Biosystems att använda fluorescerande märkta primers för detektering av reaktionsprodukter med en automatisk laserdetektor (Diehl et al., 1990) och sedan standard automatiska DNA-sekvenserare (Ziegle et al., 1992). Märkning av grundfärger med olika fluorescerande färgämnen gör att du kan analysera flera markörer samtidigt på en fil och följaktligen öka produktiviteten för metoden avsevärt och öka analysens noggrannhet.
De första publikationerna som ägnas åt användningen av SSR-analys för studien av P. infestans dök upp i början av 2000-talet. (Knapova, Gisi, 2002). Inte alla markörer som föreslagits av författarna visade en tillräcklig grad av polymorfism, men två av dem (4B och G11) ingick i uppsättningen med 12 SSR-markörer som föreslogs av Lees et al. (2006) och antogs därefter i Eucablight-forskningsnätverket (www.eucablight .org) som standard för P. infestans. Några år senare publicerades en studie om skapandet av ett system för multiplexanalys av P. infestans DNA baserat på åtta SSR-markörer (Li et al., 2010). Slutligen, efter att ha utvärderat alla tidigare föreslagna markörer och valt den mest informativa av dem, samt optimerat primers, fluorescerande etiketter och förstärkningsförhållanden, presenterade samma grupp av författare ett system för enstegs multiplexanalys, inklusive 12 markörer (Tabell 4; Li et al. , 2013a). Primrarna som användes i detta system valdes och märktes med en av fyra fluorescerande markörer (FAM, VIC, NED, PET) så att intervallen för allelstorlekar av primers med samma etiketter inte överlappade varandra.
Författarna utförde analysen på en PTC200-förstärkare (MJ Research, USA) med hjälp av QIAGEN multiplex PCR-kit eller QIAGEN Typeit Microsatellite PCR-kit. Volymen för reaktionsblandningen var 12.5 | il. Förstärkningsbetingelserna var som följer: för QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); för QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sek), 58 ° C (90 sek), 72 ° C (20 sek), 60 ° C (30 min).
Separation och visualisering av PCR-produkter utfördes med användning av en automatisk kapillär-DNA-analysator ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabell 4. Egenskaper för 12 standard SSR-markörer som används för genotypning av P. Infestans (Li et al., 2013a)
namn | Antal alleler | Storleksområde alleler (bp) | Primers |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D3100 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACAACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Ett exempel på visualisering av analysresultaten visas i fig. 6. Resultaten analyserades med GeneMapper 3.7-programvara genom att jämföra erhållen data med data från kända isolat. För att underlätta tolkningen av analysresultaten är det nödvändigt att inkludera 1-2 referensisolat med en känd genotyp i varje studie.
Den föreslagna forskningsmetoden testades på ett betydande antal fältprover, varefter författarna genomförde standardisering av protokoll mellan laboratorier från två organisationer, James Hutton Institute (UK) och Wageningen University & Research (Nederländerna), som tillsammans med möjligheten att använda standard FTA-kort för förenklat insamling och transport av P. infestans DNA-prover gjorde det möjligt att prata om möjligheten för kommersiell användning av denna utveckling. Dessutom gjorde en snabb och exakt metod för genotypning av P. infestans-isolat med multiplex SSR-analys det möjligt att genomföra standardiserade studier av populationer av denna patogen i global skala, och skapandet av en världsdatabas om senblod inom ramen för Eucablight-projektet (www.eucablight.org), inklusive , inklusive resultaten av mikrosatellitanalys, gjorde det möjligt att spåra uppkomsten och spridningen av nya genotyper runt om i världen.
Amplifierad restriktionsfragmentlängspolymorfism (AFLP). AFLP (amplifierad fragmentlängd polymorfism) är en teknik för att generera slumpmässiga molekylära markörer med användning av specifika primers. I AFLP behandlas DNA med en kombination av två restriktionsenzymer. Specifika adaptrar ligeras till de klibbiga ändarna av restriktionsfragmenten.
Dessa fragment amplifieras sedan med användning av primrar som är komplementära till adaptersekvensen och restriktionsstället och dessutom bär en eller flera slumpmässiga baser i deras 3'-ändar. Den erhållna uppsättningen av fragment beror på restriktionsenzymer och slumpmässigt utvalda nukleotider vid 3'-ändarna av primrarna (Vos et al., 1995). AFLP - genotypning används för att snabbt studera den genetiska variationen hos olika organismer.
En detaljerad beskrivning av metoden ges i Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Mycket arbete med att jämföra upplösningen av AFLP- och SSR-metoder har utförts av kinesiska forskare. De fenotypiska och genotypiska egenskaperna hos 48 P. infestans isolat från fem regioner i norra Kina studerades. AFLP-spektra avslöjade åtta olika DNA-genotyper, i motsats till SSR-genotyper, för vilka ingen mångfald hittades (Guo et al., 2008).
Förstärkning med primrar som är homologa med sekvenserna av mobila element
Markörer härledda från sekvenser av retrotransposoner är mycket praktiska för genetisk kartläggning, studier av genetisk mångfald och evolutionära processer (Schulman, 2006). Om primers görs för att komplettera de stabila sekvenserna för vissa mobila element är det möjligt att amplifiera de regioner av genomet som ligger mellan dem. I studier av det orsakande medlet för senblod applicerades framgångsrikt metoden att förstärka delar av genomet med en primer som kompletterar kärnsekvensen för SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) retropazon (Lavrova och Elansky, 2003). Med hjälp av denna metod avslöjades skillnader även i aseksuell avkomma till ett isolat. I detta avseende drogs slutsatsen att inter-SINE-PCR-metoden är mycket specifik och rörelseshastigheten för SINE-element i Phytophthora-genomet är hög.
I genomet av P. infestans har 12 familjer med korta retrotransposoner (SINE) identifierats; artsfördelningen av korta retrotransposoner undersöktes, element (SINE) identifierades som finns i genomet av endast P. infestans (Lavrova, 2004).
Funktioner i tillämpningen av metoder för jämförande studier av stammar i befolkningsstudier
När man planerar en studie måste man tydligt förstå de mål som eftersträvas och använda lämpliga metoder. Således tillåter vissa metoder att generera ett stort antal oberoende markörtecken, men samtidigt har de låg reproducerbarhet och är starkt beroende av de använda reagensen, reaktionsförhållandena och förorening av det studerade materialet. Därför är det i varje studie av en grupp stammar nödvändigt att använda flera standard (referens) isolat, men även i detta fall är resultaten av flera experiment mycket svåra att kombinera.
Denna grupp av metoder inkluderar RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Efter amplifiering erhålls ett stort antal DNA-fragment av olika storlekar. Det är tillrådligt att använda sådana tekniker när det är nödvändigt att fastställa skillnader mellan nära besläktade stammar (föräldra-avkomma, vildtypsmutanter etc.), eller i fall där en detaljerad analys av ett litet prov krävs. Således används AFLP-metoden i stor utsträckning vid genetisk kartläggning av P. infestans (van der Lee et al., 1997) och i intrapopulationsstudier (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Sådana metoder är opraktiska att använda när man skapar databaser av stammar, eftersom Det är praktiskt taget omöjligt att förena resultatredovisningen vid analyser i olika laboratorier.
Trots den verkliga enkelheten och snabbheten i utförandet (DNA-isolering utan god rening, förstärkning, visualisering av resultat) kräver denna grupp av metoder att man använder en speciell metod för att dokumentera resultaten: destillation i polyakrylamidgel med märkta (radioaktivt eller självlysande) primers och efterföljande exponering för ljus eller radioaktivt material. Konventionell avbildning av etidiumbromidagarosgel är i allmänhet inte lämplig för dessa metoder eftersom ett stort antal DNA-fragment i olika storlekar kan smälta samman.
Andra metoder gör tvärtom det möjligt att generera ett litet antal funktioner med sin mycket höga reproducerbarhet. Denna grupp inkluderar studier av mitokondriella DNA-haplotyper (endast två haplotyper Ia och IIa noteras i Ryssland), parningstyp (de flesta isolaten är indelade i två typer: A2 och A1, självfertil SF finns sällan) och peptidas-isozymspektra (två loci Pep2 och Pep1 , bestående av två isozymer vardera) och glukos-2-fosfatisomeras (i Ryssland finns det ingen variation i detta drag, även om signifikant polymorfism noteras i andra länder i världen). Det är tillrådligt att använda dessa funktioner vid analys av samlingar, sammanställning av regionala och globala databaser. När det gäller analys av isozymer och haplotyper av mitokondriellt DNA är det alls möjligt att göra utan standardstammar, medan vid analys av parningstyper krävs två testisolat med kända parningstyper.
Reaktionsförhållandena och reagenserna kan endast påverka produktens kontrast på elektroforetogrammet; det är osannolikt att manifestationer av artefakter i dessa typer av studier.
För närvarande representeras majoriteten av befolkningarna i den europeiska delen av Ryssland av stammar av båda parningstyperna (tabell 6), bland dem finns isolat med typerna Ia och IIa av mitokondriellt DNA (andra typer av mtDNA som finns i världen har inte hittats i Ryssland efter 1993). Spektra av peptidas-isozymer representeras av två genotyper vid Pep1-locus (100/100, 92/92 och heterozygote 92/100, och 92/92-genotypen är extremt sällsynt (<0,3%)) och av två genotyper på Pep 2-locus (100/100 , 112/112 och heterozygote 100/112, med genotypen 112/112 som förekommer mindre ofta än 100/100, men också ganska ofta).
Det fanns ingen variation i spektrumet av isoenzymer av glukos-6-fosfatisomeras efter 1993 (försvinnandet av klonlinjen US-1); alla studerade isolat hade genotypen 100/100 (Elansky och Smirnov, 2002).
Den tredje gruppen av metoder gör det möjligt att erhålla en tillräcklig grupp oberoende markörfunktioner med hög reproducerbarhet. Idag inkluderar denna grupp RFLP-RG57-sonden, som producerar 25-29 DNA-fragment i olika storlekar. RFLP-RG57 kan användas både vid analys av prover och kompilering av databaser. Denna metod är dock mycket dyrare än de tidigare, den är tidskrävande och kräver en tillräckligt stor mängd högrenat DNA. Därför tvingas forskaren att begränsa volymen på det testade materialet.
Utvecklingen av RFLP-RG57 i början av 90-talet under förra seklet intensifierade betydligt befolkningsstudier av orsakssubstansen för sen kitt. Det blev grunden för metoden baserad på val och analys av "klonala linjer" (se nedan). Tillsammans med RFLP-RG57 används parningstyp, DNA-fingeravtryck (RFLP-RG57-metoden), spektra av peptidas och glukos-6-fosfatisomerasisoenzymer och mitokondriell DNA-typ för att identifiera klonala linjer. Tack vare honom visades det al., 1994), ersättning av gamla befolkningar med nya (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a) och klonlinjer som råder i många länder i världen identifierades. Studier av ryska stammar med denna metod visade en hög genotypisk polymorfism av stammarna av den europeiska delen och monomorfism hos befolkningen i de asiatiska och fjärran östra delarna av Ryssland (Elansky et al, 2001). Och nu är denna metod fortfarande den viktigaste i befolkningsstudier av P. infestans. Emellertid hindras dess breda fördelning av dess ganska höga kostnad och arbetskraftsintensitet vid utförande.
En annan lovande teknik som sällan används i P. infestans-studier är microsatellite repeat (SSR) -analys. För närvarande används denna metod ofta för att isolera klonala linjer. För analys av stammar användes sådana fenotypiska markördrag som närvaron av virulensgener till potatisvarianter (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) och tomat (och används fortfarande). Nu har gener för virulens mot potatisorter tappat sitt värde som markördrag för populationsstudier på grund av uppkomsten av det maximala (eller nära det) antalet virulensgener i de allra flesta isolat. Samtidigt används fortfarande T1-virulensgenen för tomatkulturer som bär motsvarande Ph1-gen framgångsrikt som ett markördrag (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
I många arbeten används resistens mot fungicider som marköregenskaper. Detta drag är inte önskvärt att använda i populationsstudier på grund av det ganska enkla utseendet av resistensmutationer i klonala linjer efter applicering av metalaxyl- (eller mefenoxam-) innehållande fungicider i fältet. Exempelvis visades signifikanta skillnader i motståndsnivån inom Sib1-klonlinjen (Elansky et al., 2001).
Således är parningstyp, peptidas-isozymspektrum, mitokondriell DNA-typ, RFLP-RG57, SSR föredragna markörer för att skapa databanker och märka stammar i samlingar. För att jämföra begränsade prover, om det är nödvändigt att använda det maximala antalet markörfunktioner, kan du använda AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tabell 5). Det bör dock komma ihåg att dessa metoder är dåligt reproducerbara, och i varje enskilt experiment (amplifieringselektroforescykel) måste flera referensisolat användas.
Tabell 5. Jämförelse av olika metoder för forskning av stammar P. infestans
kriterium | TC | Isofer poliser | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Varv |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Mängden information | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproducerbarhet | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Möjlighet till artefakter | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Kostnad | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Arbetsintensitet | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analyshastighet ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Anmärkning: H - låg, C - medium, B - hög; НС * - arbetsintensiteten är låg när du använder agarosgel eller automatisk
genotyper, medium - genom destillation i polyakrylamidgel med märkta grundfärger,
** - räknas inte den tid som spenderas på myceltillväxt för DNA-isolering.
Befolkningsstruktur
Klonala linjer
I avsaknad av rekombination eller dess obetydliga bidrag till befolkningsstrukturen består befolkningen av ett visst antal kloner, vars genetiska utbyte är extremt sällsynta.
I sådana populationer är det mer informativt att inte studera frekvenserna för enskilda gener, utan frekvenser av genotyper som har ett gemensamt ursprung (klonala linjer eller klonala linjer) och skiljer sig endast efter punktmutationer. Befolkningsstudier av den sena röda patogenen och analysen av klonala linjer har ökat betydligt sedan tillkomsten av RFLP-RG57-metoden i början av 90-talet under förra seklet. Tillsammans med RFLP-RG57 används parningstyp, spektra av peptidas och glukos-6-fosfatisomerasisoenzymer och mitokondriell DNA-typ för att identifiera klonala linjer. Egenskaperna hos de vanligaste klonala linjerna visas i tabell 6.
Klon US-1 dominerade befolkningar överallt fram till slutet av 80-talet, varefter den började ersättas av andra kloner och försvann från Europa och Nordamerika. Det finns nu i Fjärran Östern (Filippinerna, Taiwan, Kina, Japan, Korea, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), i Afrika (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et. al., 2000; Ochwo et al., 2002) och i Sydamerika (Ecuador, Brasilien, Peru, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Inga stammar som tillhör US-1-linjen har identifierats enbart i Australien. Tydligen kom P. infestans isolat till Australien med en annan migrationsvåg (Goodwin, 1997).
Klon US-6 migrerade från norra Mexiko till Kalifornien i slutet av 70-talet och orsakade en epidemi i potatis och tomater efter 32 år av sjukdomsfri. På grund av sin höga aggressivitet ersatte den USA-1-klonen och började dominera USA: s västkust (Goodwin et al., 1995a).
Genotyperna US-7 och US-8 upptäcktes i USA 1992 och distribuerades redan 1994 i USA och Kanada. Under en fältsäsong kan klon US-8 nästan fullständigt förskjuta klon US-1 i potatisplott som ursprungligen infekterats med båda klonerna i samma koncentration (Miller och Johnson, 2000).
Kloner BC-1 till BC-4 har identifierats i British Columbia i ett litet antal isolat från Goodwin et al., 1995b). Klon US-11 spred sig mycket i USA och ersatte US-1 i Taiwan. Kloner JP-1 och EC-1, tillsammans med klon US-1, är vanliga i Japan respektive Ecuador (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 är en klon som rådde i Ryssland över ett stort territorium från Moskva-regionen till Sakhalin. I Moskva-regionen upptäcktes den 1993, och vissa fältpopulationer bestod huvudsakligen av stammar av denna klonala linje, mycket resistenta mot metalaxyl. Efter 1993 minskade förekomsten av denna klon betydligt. Utanför Ural 1997-1998 hittades SIB-1 överallt, med undantag för Khabarovsk-territoriet (klonen SIB-2 är utbredd där). Den rumsliga separationen av kloner med olika typer av parning utesluter den sexuella processen i Sibirien och Fjärran Östern. I Moskva-regionen, i motsats till Sibirien, representeras befolkningen av många kloner; nästan varje isolat har en unik multilokusgenotyp (Elansky et al., 2001, 2015). Denna mångfald kan inte förklaras enbart genom import av svampstammar från olika delar av världen med importerat utsäde. Eftersom båda typerna av parning förekommer i befolkningen är det möjligt att dess mångfald också beror på rekombination. I British Columbia antas således framväxten av genotyper BC-2, BC-3 och BC-4 på grund av hybridisering av kloner BC-1 och US-6 (Goodwin et al., 1995b). Det är möjligt att hybridstammar finns i Moskva-populationer. Till exempel kan stammar MO-4, MO-8 och MO-11 heterozygot för PEP-locus vara hybrider mellan stammar MO-12, MO-21, MO-22, med A2-parningstyp och homozygot för en allel av PEP-locus och stammen MO-8, med A1-parningstyp och homozygot för den andra allelen på locus. Och om detta är fallet, och i moderna populationer av P. infestans finns det en tendens att öka den sexuella processens roll, då kommer informationsvärdet för analysen av multilokuskloner att minska (Elansky et al., 2001, 2015).
Variation i klonala linjer
Fram till 90-talet av 20-talet var den klonala linjen US-1 utbredd i världen. De flesta av fält- och regionpopulationerna bestod uteslutande av stammar med US-1-genotypen. Emellertid observerades också skillnader mellan isolaten, troligen orsakade av en mutationsprocess. Mutationer inträffade i både kärn- och mitokondriellt DNA och påverkade bland annat resistensnivån mot fenylamidläkemedel och antalet virulensgener. Linjer som skiljer sig från de ursprungliga genotyperna genom mutationer indikeras med ytterligare siffror efter punkten efter namnet på den ursprungliga genotypen (till exempel mutantlinjen US-1.1 i klonlinjen US-1). Fingeravtrycks-DNA-linjer US-1.5 och US-1.6 innehåller tillbehörslinjer av olika storlekar (Goodwin et al., 1995a, 1995b); den klonala linjen US-6.3 skiljer sig också från US-6 med en tillbehörslinje (Goodwin, 1997, tabell 7).
I studien av mitokondriellt DNA fann man att endast mitokondriellt DNA av typ 1b finns i klonlinjen US-1 (Carter et al., 1990). I studien av stammar av denna klonal härstamning från Peru och Filippinerna hittades emellertid isolat vars mitokondriella DNA-typer skilde sig från 1b genom närvaron av insättningar och borttagningar (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabell 6. Multilokusgenotyper av vissa P. infestans klonala linjer
namn | Parningstyp | Isozymer | DNA-fingeravtryck | MtDNA-typ | |
GPI | FART | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EG-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Anmärkning: * - inga data.
Tabell 7. Multilokusgenotyper och deras mutantlinjer
namn | Parningstyp | | DNA-fingeravtryck (RG57) | Anteckningar | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Originalgenotyp 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutation i PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutation i RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutation i RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutation i RG57 och PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutation i RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Originalgenotyp 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutation i PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutation i RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutation i RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutation i RG57 och PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutation i RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Originalgenotyp 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutation i RG57 |
Det finns också förändringar i isozymernas spektra. Som regel orsakas de av nedbrytningen av en organism som ursprungligen var heterozygot för detta enzym till homozygotiska. 1993 identifierade vi på tomatfrukter en stam med egenskaper som är karakteristiska för US-1: RG57 fingeravtryck, mitokondriell DNA-typ och 86/100 genotyp för glukos-6-fosfatisomeras, men det var homozygot (100/100) för det första peptidasläget istället för en 92/100 heterozygot som är typisk för denna klonala linje. Vi namngav genotypen för denna stam MO-17 (tabell 6). Mutantlinjerna US-1.1 och US-1.4 skiljer sig också från US-1 genom mutationer vid det första peptidasläget (tabell 7).
Mutationer som leder till förändringar i antalet virulensgener för potatis- och tomatvarianter är ganska vanliga. De noterades bland isolaten från klonlinjen US-1 i populationer från Nederländerna (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polen (Sujkowski et al., 1991), norra Nordamerika (Goodwin et al., ., 1995b). Skillnader i antalet potatisvirulensgener noterades också bland isolat av klonlinjerna US-7 och US-8 i Kanada och USA (Goodwin et al., 1995a), bland isolat av SIB-1-linjen i den asiatiska delen av Ryssland (Elansky et al, 2001 ).
Isolat med starka skillnader i resistensnivåer mot fenylamidläkemedel identifierades i monoklonala fältpopulationer, som alla tillhörde den klonala linjen Sib-1 (Elansky et al, 2001, tabell 1). Nästan alla stammar av den klonala linjen US-1 är mycket mottagliga för metalaxyl; emellertid isolerades mycket resistenta isolat av denna linje i Filippinerna (Koh et al., 1994) och i Irland (Goodwin et al., 1996).
Moderna populationer av P. infestans
Centralamerika (Mexiko)
P. infestans befolkning i Mexiko skiljer sig markant från andra världspopulationer, vilket främst beror på dess historiska position. Många studier av denna population och relaterade arter av P. infestans av kladen Phytophthora, liksom lokala arter av släktet Solanum, ledde till slutsatsen att utvecklingen av patogenen i den centrala delen av Mexiko ägde rum tillsammans med utvecklingen av värdväxter och var associerad med sexuell rekombination (Grünwald, Flier 2005). Båda parningstyperna är representerade i befolkningen och i lika stora proportioner, och närvaron av oosporer i jorden på växter och knölar av potatis och vildrelaterade Solanum-arter bekräftar förekomsten av en sexuell process i befolkningen (Fernández-Pavía et al., 2002). Nya studier av Tolucadalen och dess omgivningar (det antagande ursprunget för patogenen) bekräftade den höga genetiska mångfalden hos lokalbefolkningen av P. infestans (134 multilocus-genotyper i ett urval av 176 prover) och förekomsten av flera differentierade delpopulationer i regionen (Wang et al., 2017). De faktorer som bidrar till denna differentiering är den rumsliga uppdelningen av delpopulationer som är karakteristiska för höglandet i centrala Mexiko, skillnader i odlingsförhållanden och potatisvarianter som används i dalar och berg och förekomsten av vilda tuberösa Solanum-arter som kan fungera som alternativa värdar (Fry et al. ., 2009).
Det bör dock noteras att populationerna av P. infestans i norra Mexiko är mer klonala och mer liknar de nordamerikanska befolkningarna, vilket kan indikera att det här är de nya genotyperna (Fry et al., 2009).
Nordamerika
De nordamerikanska populationerna av P. infestans har alltid haft en mycket enkel struktur och deras klonala karaktär etablerades långt före användning av mikrosatellitanalys. Fram till 1987 dominerade den klonala linjen US-1 i USA och Kanada (Goodwin et al., 1995). I mitten av 70-talet, när metalaxylbaserade fungicider dök upp, började denna klon ersättas med andra, mer resistenta genotyper som migrerade från Mexiko (Goodwin et al., 1998). I slutet av 90-talet. US-8-genotypen ersatte fullständigt US-1-genotypen i USA och blev den dominerande klonlinjen på potatis (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Situationen var annorlunda med tomater, som ständigt innehöll flera klonala linjer, och deras sammansättning förändrades från år till år (Fry et al., 2009).
2009 utbröt en storskalig epidemi av senblod i USA på tomater. Ett inslag i denna pandemi var dess nästan samtidiga utbrott på många ställen i nordöstra USA, och det visade sig vara förknippat med massiv försäljning av infekterade tomatplantor i stora trädgårdscentra (Fry et al., 2013). Grödförlusterna var enorma. Mikrosatellitanalys av de drabbade proverna avslöjade att pandemistammen tillhör den klonade linjen US-22 A2 parningstyp. År 2009 nådde andelen av denna genotyp i den amerikanska befolkningen av P. infestans 80% (Fry et al., 2013). Under de följande åren ökade andelen aggressiva genotyper US-23 (huvudsakligen på tomater) och US-24 (på potatis) stadigt i befolkningen, men efter 2011 minskade detektionsgraden av US-24 signifikant och hittills cirka 90% av patogenpopulationen i USA representeras av US-23-genotypen (Fry et al., 2015).
I Kanada, som i USA, i slutet av 90-talet. den dominerande genotypen US-1 ersattes av US-8, vars dominerande positioner var oförändrade fram till 2008. I Kanada förekom allvarliga senblodsepidemier i samband med försäljningen av infekterade tomatplantor, men de orsakades av genotyperna US-2009 och US-2010 (Kalischuk et al., 23). Den tydliga geografiska differentieringen av dessa genotyper var anmärkningsvärd: USA-8 dominerade de västra provinserna i Kanada (2012%), medan USA-23 dominerade de östra provinserna (68%). De efterföljande åren spred sig USA-8 till de östra regionerna, men i allmänhet minskade dess andel i befolkningen något mot bakgrund av genotypen US-83 och US-23 i landet (Peters et al., 22). Hittills har US-24 en dominerande ställning i hela Kanada; US-2014 finns i British Columbia, medan US-23 och US-8 finns i Ontario (Peters, 23).
Således är de nordamerikanska populationerna av P. infestans huvudsakligen klonala linjer. Under de senaste 40 åren har antalet upptäckta klonala genotyper nått 24. Trots att stammar av båda typerna av parning förekommer i befolkningen är sannolikheten för att nya genotyper uppträder som ett resultat av sexuell rekombination fortfarande ganska låg. Under de senaste 20 åren har dock flera fall av förekomst av kortvariga rekombinanta populationer registrerats (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), och i ett fall var resultatet av korsningen genotypen US-11 , som var förankrad i Nordamerika under många år (Gavino et al., 2000). Fram till 2009 var förändringar i befolkningsstrukturen associerade med uppkomsten av nya, mer aggressiva genotyper med deras efterföljande migration och förflyttning av tidigare dominerande föregångare. Vad som hände 2009-2010 i USA och Kanada visade epifytotika för första gången att i globaliseringens era kan sjukdomsutbrott förknippas med aktiv spridning av nya genotyper vid försäljning av infekterat planteringsmaterial.
Sydamerika
Fram till nyligen var studier av de sydamerikanska populationerna av P. infestans varken vanliga eller i stor skala. Det är känt att dessa populationers struktur är ganska enkel och inkluderar 1-5 klonala linjer per land (Forbes et al., 1998). Så, 1998, var genotyperna US-1 (Brasilien, Chile) BR-1 (Brasilien, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Colombia, Peru och Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 och AR-5 (Argentina), PE-3 och PE-7 (södra Peru). Parningstyp A2 fanns i Brasilien, Bolivia och Argentina och hittades inte utanför den bolivianska-peruanska gränsen i Titicacasjön, bakom vilken EC-1 A1-genotypen dominerade i Anderna. På tomater förblev US-1 den dominerande genotypen i hela Sydamerika.
Situationen kvarstod mer eller mindre under 2000-talet. En viktig punkt var upptäckten av en ny klonal linje EC-2 av A2-typen på vilda släktingar till potatis (S. brevifolium och S. tetrapetalum) i norra Anderna (Oliva et al., 2010). Fylogenetiska studier har visat att denna linje inte är helt identisk med P. infestans, även om den är nära besläktad med den, föreslogs i detta sammanhang att överväga den, liksom en annan linje, EC-3, isolerad från tomatträdet S. betaceum som växer i Anderna, en ny art som heter P. andina; emellertid är statusen för denna art (en oberoende art eller en hybrid av P. infestans med någon fortfarande okänd linje) fortfarande oklar (Delgado et al., 2013).
För närvarande är alla sydamerikanska populationer av P. infestans klonala. Trots närvaron av båda typerna av parning har inga rekombinanta populationer identifierats. På tomater är US-1-genotypen allestädes närvarande, tydligen förskjuten från potatis av lokala stammar, vars exakta ursprung fortfarande är okänt. I Brasilien, Bolivia och Uruguay är BR-1-genotypen närvarande; i Peru, tillsammans med US-1 och EC-1, finns det flera andra lokala genotyper. I Anderna bibehålls den dominerande positionen av klonlinjen EC-1, vars förhållande till den nyligen upptäckta P. andina fortfarande är okänd. Den enda "instabila" platsen där för perioden 2003-2013. det skedde betydande förändringar i befolkningen, blev Chile (Acuña et al., 2012), där 2004-2005. patogenpopulationen kännetecknades av resistens mot metalaxyl och en ny mitokondriell DNA-haplotyp (la istället för tidigare närvarande Ib). 2006 till 2011 i befolkningen dominerade genotyp 21 (enligt SSR), vars andel nådde 90%, varefter handflatan övergick till genotyp 20, vars frekvens av förekomst under de kommande två åren hölls på cirka 67% (Acuña, 2015).
Europa
I Europas historia fanns det minst två migrationsvågor av P. infestans från Nordamerika: på 1-talet. (HERB-1) och tidigt 70-tal (US-1). Den allestädes närvarande fördelningen av metalaxylinnehållande fungicider på XNUMX-talet. ledde till förskjutning av den dominerande genotypen US-XNUMX och dess ersättning med nya genotyper. Som ett resultat, i de flesta länder i Västeuropa representerades patogenpopulationerna huvudsakligen av flera klonala linjer.
Användningen av mikrosatellitanalys för analysen av patogenpopulationer gjorde det möjligt att avslöja allvarliga förändringar som inträffade i Västeuropa 2005–2008. 2005 upptäcktes en ny klonal linje i Storbritannien, kallad 13_A2 (eller “Blue 13”) och kännetecknas av parningstypen A2 , hög aggressivitet och resistens mot fenylamider (Shaw et al., 2007). Samma genotyp hittades i prover som samlades in 2004 i Nederländerna och norra Frankrike, vilket föreslog att den migrerade till Storbritannien från kontinentaleuropa, eventuellt med utsädespotatis (Cooke et al., 2007). Studien av genomet av representanter för denna klonala linje visade en hög grad av polymorfism i dess sekvens (år 2016 nådde antalet subklonala variationer 340) och en signifikant grad av variation i nivån på genuttryck, inkl. effektorgener under växtinfektion (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Dessa funktioner, tillsammans med den ökade varaktigheten för den biotrofiska fasen, kan orsaka en ökad aggressivitet av 13_A2 och dess förmåga att infektera även potatisorter som är resistenta mot senblod.
Under de närmaste åren spred sig genotypen snabbt över länderna i nordvästra Europa (Storbritannien, Irland, Frankrike, Belgien, Nederländerna, Tyskland) med samtidig förskjutning av de tidigare dominerande genotyperna 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Enligt webbplatsen www.euroblight.net nådde andelen 13_A2 i befolkningen i dessa länder 60-80% och mer; närvaron av denna genotyp har också registrerats i vissa länder i östra och södra Europa. Men under 2009-2012. 13_A2 förlorade sina dominerande positioner i Storbritannien och Frankrike och gav efter 6_A1-linjen (8_A1 i Irland), och i Nederländerna och Belgien ersattes den delvis av genotyper 1_A1, 6_A1 och 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Hittills är cirka 70% av den västeuropeiska befolkningen av P. infestans monoklonala. Enligt webbplatsen www.euroblight.net är de dominerande genotyperna i länderna i Nordvästra Europa (Storbritannien, Frankrike,
Nederländerna, Belgien) kvarstår, ungefär lika stora, 13_A2 och 6_A1, det senare finns praktiskt taget inte utanför den angivna regionen (med undantag för Irland), men har redan minst 58 subkloner (Cooke, 2017). Variationer 13_A2 finns i märkbart antal i Tyskland och observeras också sporadiskt i länderna i Central- och Sydeuropa. Genotyp 1_A1 utgör en betydande del av befolkningen i Belgien och delvis Nederländerna och Frankrike. Genotyp 8_A1 har stabiliserats i den europeiska befolkningen på 3-6%, med undantag för Irland, där den behåller sin ledande position och är indelad i två underkloner (Stellingwerf, 2017). Slutligen noterades 2016 en ökning av förekomsten av nya genotyper 36_A2 och 37_A2, som först registrerades 2013-2014. Hittills finns dessa genotyper i Nederländerna och Belgien och delvis i Frankrike och Tyskland samt i södra delen av Storbritannien (Cooke, 2017). Cirka 20-30% av den västeuropeiska befolkningen representeras av unika genotyper varje år.
Till skillnad från Västeuropa representerades befolkningen i norra Europa (Sverige, Norge, Danmark, Finland) när klassen 13_A2 uppstod inte av klonala linjer utan av ett stort antal unika genotyper (Brurberg et al.
2011). Under perioden med aktiv spridning av 13_A2 i Västeuropa observerades förekomsten av denna genotyp i Skandinavien inte förrän 2011, då den först upptäcktes i Nordjylland (Danmark), där huvudsakligen industriella potatisorter odlas med aktiv användning av metallaxylinnehållande fungicider (Nielsen et al., 2014). Enligt www.euroblight.net upptäcktes genotyp 13_A2 också i flera prover från Norge och Danmark 2014 och i flera norska prover 2016; dessutom noterades förekomsten av genotyp 2013_A6 i en liten mängd i Finland. Den främsta orsaken till misslyckandet med 1_A13 och andra klonala linjer i erövringen av Skandinavien anses vara klimatskillnaderna i denna region från länderna i Västeuropa.
Förutom det faktum att svala somrar och kalla vintrar bidrar till överlevnaden av inte så mycket vegetativt mycel som oosporer (Sjöholm et al., 2013), bidrar jordfrysning på vintern (som vanligtvis inte förekommer i varmare länder i Västeuropa) till synkroniseringen av oospores spiring och plantering. potatis, vilket förstärker deras roll som en källa till primär infektion (Brurberg et al., 2011). Det bör också noteras att under norra förhållanden övergår utvecklingen av infektion från oosporer utvecklingen av tuberös infektion, vilket i slutändan förhindrar dominansen av ännu mer aggressiva, men senare utvecklade klonala linjer (Yuen, 2012). Strukturen för de mest studerade populationerna av P. infestans i länderna i Östeuropa (Polen, de baltiska staterna) är mycket lik den i Skandinavien.
Båda typerna av parning finns också här och de allra flesta genotyper som bestäms av SSR-analys är unika (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Liksom i norra Europa påverkade spridningen av klonala linjer (främst av 13_A2-genotypen) praktiskt taget inte de lokala populationerna av patogenen, som bibehåller en hög mångfaldsnivå med avsaknad av uttalade dominerande linjer.
Förekomsten av 13_A2 observeras ibland i åkrar med kommersiella potatisorter. I Ryssland utvecklas situationen på ett liknande sätt. Mikrosatellitanalys av P. infestans-isolat som samlades in 2008-2011 i tio olika regioner i den europeiska delen av Ryssland, visade en hög grad av genotypisk mångfald och en fullständig brist på sammanfall med europeiska klonala linjer (Statsyuk et al., 10). Flera år senare visade en studie av P. infestans-prover som samlats in i Leningrad-regionen 2014-2013 signifikanta skillnader mellan dem och de genotyper från denna region som identifierades i den tidigare studien. I båda studierna hittades inga västeuropeiska genotyper (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2014).
Den höga genetiska mångfalden hos de östeuropeiska populationerna av P. infestans och frånvaron av dominerande klonala linjer i dem kan relateras till flera orsaker. För det första, som i Nordeuropa, bidrar klimatförhållandena i de betraktade länderna till bildandet av oosporer som en primär infektionskälla (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). För det andra odlas en betydande andel potatis som produceras i dessa länder på små privata gårdar, ofta omgivna av skog eller andra hinder för den fria rörligheten för infektiöst material (Chmielarz et al., 2014). Som regel behandlas potatis som odlas under sådana förhållanden praktiskt taget inte med kemikalier, och valet av sorter baseras på deras motståndskraft mot senblod, dvs. det finns inget selektivt tryck för aggressivitet och resistens mot metalaxyl, vilket berövar resistenta genotyper, såsom 13_A2, fördelar jämfört med andra genotyper (Chmielarz et al., 2014). Slutligen, på grund av den lilla storleken på tomter, brukar deras ägare vanligtvis inte odla växter, odla potatis på samma plats i flera år, vilket bidrar till ackumuleringen av ett genetiskt varierat inokulat (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
asia
Fram till nyligen förblev P. infestans befolkning i Asien relativt dåligt förstådd. Det var känt att det huvudsakligen representeras av klonala linjer, och effekten av sexuell rekombination på uppkomsten av nya genotyper är mycket liten. Så till exempel 1997-1998. I den asiatiska delen av Ryssland (Sibirien och Fjärran Östern) representerades patogenpopulationen av endast tre genotyper med en övervägande av SIB-1-genotypen (Elansky et al., 2001). Förekomsten av klonala patogenlinjer har visats i länder som Kina, Japan, Korea, Filippinerna och Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Den klonala linjen US-1, som dominerade över ett stort territorium i Asien, i slutet av 90-talet - början av 2000-talet. nästan överallt började ersättas med andra genotyper, som i sin tur gav plats för nya. I de flesta fall var förändringar i befolkningens struktur och sammansättning i asiatiska länder associerade med migrationen av nya genotyper utifrån. Så i Japan, med undantag av JP-3-genotypen, har alla andra japanska genotyper som uppträdde efter US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) mer eller mindre bevisat externt ursprung (Akino et al., 2011) ... Det finns för närvarande tre huvudpatogenpopulationer i Kina, som har en tydlig geografisk indelning. Det finns inget eller mycket svagt genflöde mellan dessa populationer (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotyp 13_A2 uppträdde på Kinas territorium i dess södra provinser (Yunnan och Sichuan) 2005-2007 och 2012-1014. sågs också i nordöstra delen av landet (Li et al., 2013b). I Indien uppträdde förmodligen 13_A2 samtidigt som i Kina, troligen med infekterade utsädespotatis (Chowdappa et al., 2015) och 2009-2010. orsakade en allvarlig epifytotisk sjukdom med senblod på tomat i södra delen av landet, varefter den sprids till potatis och 2014 orsakade ett utbrott av senblod i västra Bengal, vilket ledde till ruin och självmord hos många lokala bönder (Fry, 2016).
Африка
Fram till 2008-2010 systematiska studier av P. infestans i afrikanska länder har inte genomförts. För närvarande kan de afrikanska befolkningarna av P. infestans delas in i två grupper, och denna uppdelning är tydligt associerad med faktumet av importen av utsädespotatis från Europa.
I Nordafrika, som aktivt importerar utsädespotatis från Europa, är parningstypen A2 allmänt representerad i nästan alla regioner, vilket ger en teoretisk möjlighet till uppkomsten av nya genotyper som ett resultat av sexuell rekombination (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Dessutom noteras i Algeriet närvaron av genotyperna 13_A2, 2_A1 och 23_A1 med en uttalad dominans hos den första av dem, liksom en gradvis minskning av andelen unika genotyper till fullständigt försvinnande (Rekad et al., 2017). I motsats till resten av regionen, i Tunisien (med undantag för nordöstra delen av landet), representeras patogenpopulationen främst av parningstypen A1 (Harbaoui et al., 2014).
Den klonala linjen NA-01 dominerar här. I allmänhet är andelen klonala linjer i befolkningen bara 43%. I östra och södra Afrika, där volymen av utsädeimport är försvinnande liten (Fry et al., 2009), representeras P. infestans av endast två klonala linjer av A1-typ, US-1 och KE-1, och den senare förskjuter aktivt den förra på potatis ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Hittills har båda dessa genotyper ett märkbart antal subklonala variationer.
Australien
Den första rapporten om sena skador på potatis i Australien går tillbaka till 1907, och den första epifytotin, förmodligen orsakad av kraftiga regn under sommarmånaderna, inträffade 1909-1911. (Drenth et al., 2002). I allmänhet har senblod dock ingen betydande ekonomisk betydelse för landet. Sporadiska utbrott av sen skymning, orsakade av väderförhållanden som ger hög luftfuktighet, förekommer inte mer än en gång vart 5-7 år och lokaliseras främst i norra Tasmanien och centrala Victoria. I samband med ovanstående är publikationer som ägnas åt studiet av strukturen hos den australiska befolkningen av P. infestans praktiskt taget frånvarande. Den senaste tillgängliga informationen är från 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Enligt författarna var Victoria-befolkningen en klonal linje US-1.3, vilket indirekt bekräftade migrationen av denna genotyp från USA. Tasmaniska prover klassificerades som AU-3, skiljer sig från de genotyper som fanns vid den tiden i andra delar av världen.
Funktioner för utvecklingen av senblod i Ryssland
I Europa infekterades infektioner med sjuka fröknölar, oosporer som övervintrade i jorden, liksom zoosporangia som fördes av vinden från växter som odlats från övervintrade knölar i förra årets åkrar ("frivilliga" växter) eller på massor av avlivade bokmärke för förvaring av knölar. Av dessa anses växter som odlas på massor av kasserade knölar vara den farligaste infektionskällan. där är antalet groddknölar ofta betydande och zoosporangia kan bäras från dem över långa avstånd. Resten av källorna (oosporer, "frivilliga" växter) är inte så farliga, för det är inte vanligt att odla växter i samma fält oftare än en gång vart tredje år. Infektion från sjuka fröknölar är också minimal på grund av ett bra system för utsädeskvalitet.
I allmänhet är mängden inokulum i europeiska befolkningar begränsad, och därför är ökningen av epidemin ganska långsam och kan framgångsrikt kontrolleras med kemiska fungicider. Huvuduppgiften under europeiska förhållanden är kampen mot infektion i den fas då massfördelningen av zoosporangia från drabbade växter börjar.
I Ryssland är situationen radikalt annorlunda. Det mesta av potatis- och tomatgrödan odlas i små privata trädgårdar; antingen utförs inte skyddsåtgärder alls, eller så utförs svampdödande behandlingar i ett otillräckligt antal och börjar efter uppkomsten av sen skam på topparna. Som ett resultat fungerar privata grönsaksträdgårdar som den främsta infektionskällan, från vilken zoosporangia transporteras av vinden till kommersiella planteringar. Detta bekräftas av våra direkta observationer i Moskva, Bryansk, Kostroma, Ryazan-regionerna: skador på växter i privata trädgårdar observeras redan innan påbörjandet av fungicidbehandlingar för kommersiella planteringar. Därefter begränsas epidemin i stora fält genom användning av svampdödande preparat, medan det i privata trädgårdar sker en snabb utveckling av senblod.
I händelse av felaktiga eller "budgetmässiga" behandlingar av kommersiella planteringar uppträder foci för sena rötor i fälten; senare utvecklas de aktivt och täcker allt större områden (Elansky, 2015). Infektion i privata trädgårdar har en betydande inverkan på epidemier i kommersiella fält. I alla Rysslands potatisodlingsregioner är det område som ockuperas av potatis i privata trädgårdar flera gånger större än det totala området för stora producenters åkrar. I en sådan miljö kan privata grönsaksträdgårdar ses som en global ympresurs för kommersiella fält. Låt oss försöka identifiera de egenskaper som är karakteristiska för genotyperna av stammar i privata trädgårdar.
Plantering av icke-utsäde- och karantänkontroll av potatis, tomatfrön som erhållits från tvivelaktiga utländska producenter, långvarig odling av potatis och tomater på samma områden, felaktig behandling av svampdödande medel eller deras fullständiga frånvaro leder till allvarliga epifytotika i den privata sektorn, vars resultat är gratis korsning, hybridisering och bildandet av oosporer i privata trädgårdar. Som ett resultat observeras en mycket hög genotypisk mångfald av patogenen, när nästan varje stam är unik i sin genotyp (Elansky et al., 2001, 2015). Att plantera utsädespotatis av olika genetiska ursprung gör det osannolikt att klonala linjer som är specialiserade för att angripa en viss sort kommer fram. De stammar som valts i ett sådant fall kännetecknas av sin mångsidighet i förhållande till de drabbade sorterna, de flesta av dem har ett nästan maximalt antal virulensgener. Detta skiljer sig väldigt mycket från systemet med "klonala linjer" som är typiska för stora fält av jordbruksföretag med ett korrekt installerat system för skydd mot senblod. "Klonala linjer" (när alla stammar av senblodspatogenen i fältet representeras av en eller flera genotyper) är allestädes närvarande i länder där potatisodling uteslutande utförs av stora gårdar: USA, Nederländerna, Danmark, etc. I England, Irland, Polen, där hushållstomter traditionellt också är utbredda potatisodling finns det också en högre genotypisk mångfald i privata trädgårdar. I slutet av 20-talet var ”klonala linjer” utbredda i de asiatiska och fjärran östra delarna av Ryssland (Elansky et al., 2001), vilket tydligen beror på att samma potatisvarianter endast används för plantering. Nyligen började situationen i dessa regioner också förändras mot att öka den genotypiska mångfalden hos befolkningen.
Bristen på intensiva behandlingar med svampdödande preparat har en annan, direkt konsekvens - det finns ingen ansamling av resistenta stammar i trädgårdarna. Våra resultat visar faktiskt att metalaxylresistenta stammar finns betydligt mindre ofta i privata trädgårdar än i kommersiella planteringar.
Närheten av potatis- och tomatplantningar, som är typiska för privata trädgårdar, underlättar migrering av stammar mellan dessa grödor, vilket resulterade under det senaste decenniet bland de stammar som isolerats från potatis, andelen stammar som bär genen för resistens mot körsbärstomatsorter (T1), som tidigare endast var karakteristiska för tomatstammar. Stammar med T1-genen är i de flesta fall mycket aggressiva mot både potatis och tomater.
Under de senaste åren började sen skada på tomat uppträda i många fall tidigare än på potatis. Tomatplantor kan infekteras av oosporer i jorden, eller oosporer som finns i tomatfrön eller vidhäftar till dem (Rubin et al., 2001). Under de senaste 15 åren har ett stort antal billiga förpackade frön, främst importerade, dykt upp i butikerna, och de flesta av de små producenterna har bytt till att använda dem. Fröna kan ge stammar med genotyper som är typiska för regionerna för deras odling. I framtiden ingår dessa genotyper i den sexuella processen i privata trädgårdar, vilket leder till framväxten av helt nya genotyper.
Således kan det konstateras att privata trädgårdar är en global "smältdegel" där, som ett resultat av utbytet av genetiskt material, existerar genotyper bearbetas och helt nya dyker upp. Samtidigt sker deras urval under förhållanden som skiljer sig mycket från de som skapats för potatis på stora gårdar: frånvaro av svampdödande press, sortens enhetlighet hos planteringar, övervägande av växter som påverkas av olika former av virus- och bakterieinfektion, närhet till tomater och vilda nattskuggor, aktiv korsning och oosporbildning, möjligheten för oosporer att fungera som en infektionskälla nästa år.
Allt detta leder till en mycket hög genotypisk mångfald av bakgårdspopulationer. Under epifytotiska förhållanden sprider sig senblod mycket snabbt i grönsaksgårdar och stora mängder sporer frigörs, som flyger till närliggande kommersiella planteringar. Efter att ha kommit in i de kommersiella fälten med rätt system för jordbruksteknik och kemiskt skydd har sporerna som har kommit praktiskt taget ingen möjlighet att initiera epifytotika i fältet, vilket beror på frånvaron av klonala linjer som är resistenta mot fungicider och specialiserade på den odlade sorten.
En annan källa till primär ympning kan vara sjuka knölar som fångats i kommersiella plantor. Dessa knölar odlades som regel i fält med god jordbruksteknik och intensivt kemiskt skydd. Genotyperna av isolaten som påverkade knölarna är anpassade till utvecklingen av sin egen sort. Dessa stammar är betydligt farligare för kommersiell plantering än inokulum som härrör från privata trädgårdar. Resultaten av vår forskning stöder också detta antagande. Befolkningar isolerade från stora fält med korrekt utfört kemiskt skydd och god jordbruksteknik skiljer sig inte åt i hög genotypisk mångfald. Ofta är detta flera klonala linjer som är mycket aggressiva.
Stammar från kommersiellt utsädesmaterial kan komma in i populationer i grönsaksgårdar och vara involverade i de processer som pågår i dem. Men i en grönsaksträdgård kommer deras konkurrenskraft att vara mycket lägre än inom ett kommersiellt område, och snart kommer de att upphöra att existera i form av en klonal linje, men deras gener kan användas i "trädgård" -populationen.
Infektionen som utvecklas på "frivilliga" växter och på massor av avlivade knölar under skörden är inte så relevant för Ryssland, eftersom I de viktigaste potatisodlingsregionerna i Ryssland observeras frysning av djup vinterjord och växter från knölar som har övervintrat i jorden utvecklas sällan. Dessutom, som våra experiment visar, överlever inte den sena röda patogenen vid negativa temperaturer även på knölar som har behållit sin livskraft. I den torra zonen, där odling av tidig potatis utövas, är senblod ganska sällsynt på grund av den torra och heta växtsäsongen.
Således observerar vi för närvarande uppdelningen av P. infestans populationer i "fält" och "trädgård" populationer. Under senare år har emellertid processer observerats som leder till konvergens och interpenetration av genotyper från dessa populationer.
Bland dem kan man notera en allmän ökning av små producenters läskunnighet, framväxten av prisvärda små förpackningar med utsädespotatis, spridningen av svampdödande preparat i små förpackningar och förlusten av rädslan för "kemi" av befolkningen.
Situationer uppstår när, tack vare en leverantörs kraftfulla aktivitet, hela byar planteras med fröknölar av samma sort och försedda med små förpackningar av samma bekämpningsmedel. Man kan anta att potatis av samma sort kommer att finnas på kommersiella planteringar i närheten.
Å andra sidan marknadsför vissa bekämpningsmedelsföretag "budget" kemiska behandlingssystem. I det här fallet underskattas antalet rekommenderade behandlingar och de billigaste fungiciderna erbjuds, och tyngdpunkten ligger inte på att förhindra utvecklingen av senblod fram till klippning av topparna utan på viss fördröjning av epifytoty för att öka utbytet. Sådana system är ekonomiskt motiverade vid odling av potatis från lågkvalitativt utsäde, när det i princip inte är fråga om att få hög avkastning. I detta fall, i motsats till trädgårdspopulationerna, bidrar emellertid den utjämnade genetiska bakgrunden till potatisen till valet av specifika fysiologiska raser, som är mycket farliga för denna sort.
Generellt sett tycks tendenser mot konvergens mellan "trädgård" och "fält" metoder för potatisproduktion för oss vara ganska farliga. För att förhindra de negativa konsekvenserna, både i hemmet och i kommersiella sektorer, kommer det att vara nödvändigt att kontrollera både sortimentet av utsädespotatis och utbudet av svampdödande medel som erbjuds privata ägare i små förpackningar, samt spåra potatisskyddssystem och användningen av svampmedel i den kommersiella sektorn.
Inom områdena inom den privata sektorn sker en intensiv utveckling av inte bara sen skada, utan även Alternaria. De flesta ägare av privata tomter vidtar inga speciella åtgärder för att skydda mot Alternaria, och misstänker utvecklingen av Alternaria för att den naturliga vissningen av topparna eller utvecklingen av senblod. Därför, med den massiva utvecklingen av Alternaria på mottagliga sorter, kan hushållstomter tjäna som källa till ympning för kommersiella planteringar.
Mekanismer för variation
Mutationsprocess
Eftersom förekomsten av mutationer är en slumpmässig process som fortsätter med låg frekvens beror förekomsten av mutationer på vilket som helst ställe på mutationsfrekvensen för detta ställe och befolkningens storlek. När man studerar mutationsfrekvensen av P. infestans-stammar bestäms vanligtvis antalet kolonier som odlas på selektiva näringsmedier efter behandling med kemiska eller fysiska mutagener. Som framgår av data som presenteras i tabell 8 kan mutationsfrekvensen för samma stam vid olika loci variera med flera storleksordningar. Den höga frekvensen av mutationer i resistens mot metalaxyl kan vara en av anledningarna till ackumulering av stammar som är resistenta mot den i naturen.
Frekvensen av spontana eller inducerade mutationer, beräknad på grundval av laboratorieexperiment, motsvarar inte alltid de processer som förekommer i naturliga populationer av följande skäl:
1. Med asynkrona kärnklyvningar är det omöjligt att uppskatta frekvensen av mutationer per en kärngeneration. Därför ger de flesta experiment information endast direkt om mutationsfrekvensen, utan att skilja mellan två mutationshändelser och en händelse efter mitos.
2. Enstegsmutationer minskar vanligen balansen i genomet, därför minskar organismens allmänna kondition tillsammans med förvärvet av en ny egenskap. De flesta av de experimentellt erhållna mutationerna har minskad aggressivitet och registreras inte i naturliga populationer. Således var korrelationskoefficienten mellan resistensen hos P. infestans mutanter mot fenylamid-fungicider och tillväxthastigheten på ett artificiellt medium i genomsnitt (-0,62), och resistensen mot fungicider och aggressivitet på potatisblad (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), vilket indikerar mutanternas låga kondition. Mutationer i resistens mot dimetomorf åtföljdes också av en kraftig minskning av livskraften (Bagirova et al., 2001).
3. Majoriteten av spontana och inducerade mutationer är recessiva och manifesterar sig inte fenotypiskt i experiment utan utgör en dold reserv för variation i naturliga populationer. Mutantstammar som isolerats i laboratorieexperiment bär dominerande eller halvdominerande mutationer (Kulish och Dyakov, 1979). Tydligen förklarar kärndiploidi misslyckade försök att få mutanter under påverkan av UV-strålning som är virulenta på tidigare resistenta sorter (McKee, 1969). Enligt författarens beräkningar kan sådana mutationer uppstå med en frekvens mindre än 1: 500000 XNUMX. Övergången av recessiva mutationer till ett homozygot, fenotypiskt uttryckt tillstånd kan inträffa på grund av sexuell eller asexuell rekombination (se nedan). Men även i det här fallet kan mutationen maskeras av de dominerande allelerna av vildtypskärnorna i det cenotiska (multikärnade) myceliet och fixeras fenotypiskt endast under bildandet av mononukleära zoosporer.
Tabell 8. Frekvens av P. infestans mutationer till tillväxthämmande substanser under inverkan av nitrosometylurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
förening | Mutationsfrekvens |
Oxytetracyklin | 6,9 10 X-8 |
Blasticidin S. | X 7,2 10-8 |
Streptomycin | 8,3 x10-8 |
Trikotecin | 1,8 10 X-8 |
Cykloheximid | 2,1 10 X-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 X-7 |
Metalaxil | 6,9 10 X-6 |
Befolkningsstorlekar spelar också en avgörande roll i förekomsten av spontana mutationer. I mycket stora populationer, där antalet celler N> 1 / a, där a är mutationshastigheten, upphör mutationen att vara ett slumpmässigt fenomen (Kvitko, 1974).
Beräkningar visar att med en genomsnittlig angrepp av ett potatisfält (35 fläckar per växt) bildas 8x1012 sporer dagligen per hektar (Dyakov och Suprun, 1984). Uppenbarligen innehåller sådana populationer alla mutationer som tillåts av typen av utbyte på varje plats. Även en sällsynt mutation, som förekommer med frekvensen 10-9, kommer att förvärvas av tusen individer av miljoner som lever på en hektar potatisfält. För mutationer som uppträder med en högre frekvens (till exempel 10-6), i en sådan population, kan olika parade mutationer uppträda dagligen (samtidigt vid två loci), d.v.s. mutationsprocessen kommer att ersätta rekombination.
Migrationer
För P. infestans är två huvudtyper av migration kända: att stänga avstånd (inom ett potatisfält eller angränsande åkrar) genom att sprida zoosporangia med luftströmmar eller regnspray och till långa avstånd - med plantering av knölar eller transporterade tomatfrukter. Den första metoden ger en utvidgning av sjukdomsfokus, den andra - skapandet av nya foci på platser som ligger långt från det primära.
Spridningen av infektion med tomatknölar och frukt bidrar inte bara till att sjukdomen uppträder på nya platser utan är också den viktigaste källan till genetisk mångfald i populationer. I Moskva-regionen odlas potatis från olika regioner i Ryssland och Västeuropa. Tomatfrukter kommer från de södra regionerna i Ryssland (Astrakhan-regionen, Krasnodar-regionen, norra Kaukasus). Tomatfrön, som också kan fungera som smittkällor (Rubin et al., 2001), importeras också från de södra regionerna i Ryssland, Kina, europeiska länder och andra länder.
Enligt beräkningar av E. Mayr (1974) överstiger genetiska förändringar i en lokal befolkning orsakade av mutationer sällan 10-5 per lokus, medan i öppna populationer är utbytet på grund av motflödet av gener minst 10-3 - 10-4.
Migration i infekterade knölar är ansvarig för att P. infestans träder in i Europa och sprider sig till alla regioner i världen där potatis odlas; de orsakade de allvarligaste befolkningsförändringarna. Sen skada på potatis uppträdde på det ryska imperiets territorium nästan samtidigt med dess utseende i Västeuropa.
Eftersom sjukdomen först noterades 1846-1847 i de baltiska staterna och först under senare år sprids i Vitryssland och de nordvästra regionerna i Ryssland, är dess västeuropeiska ursprung uppenbart. Den första källan till senblåsa i den gamla världen är inte så uppenbar. Hypotesen utvecklad av Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) antyder att parasiten först kom från Mexiko till Nordamerika, där den sprids genom grödor och sedan transporterades till Västeuropa. (fig. 7).
Som ett resultat av den upprepade drivningen (dubbel effekt av "flaskhalsen") kom enskilda kloner till Europa, vars avkommor orsakade en pandemi i hela den gamla världens territorium, där potatis odlas. Som bevis på denna hypotes citerar författarna för det första allvaret av endast en typ av parning (A1) och för det andra homogeniteten hos genotyperna av de studerade stammarna från olika regioner (alla är baserade på molekylära markörer, inklusive 2 isozyme loci, DNA-fingeravtrycksmönster och strukturen för mitokondriellt DNA är identisk och motsvarar den klon US-1 som beskrivs i USA). Vissa uppgifter väcker dock tvivel om åtminstone några av bestämmelserna i den angivna hypotesen. Analys av P. infestans mitokondriellt DNA isolerat från herbariumpotatisprover infekterade under den första epifytotiska perioden på 40-talet visade att de skiljer sig åt i strukturen för mitokondriellt DNA från klon US-1, vilket därför var åtminstone inte den enda infektionskällan i Europa (Ristaino et al, 2001).
Senblodsläget förvärrades igen på 80-talet av XX-talet. Följande ändringar har inträffat:
1) Befolkningens genomsnittliga aggressivitet har ökat, vilket i synnerhet har lett till en utbredd spridning av den mest skadliga formen av senblåsa - skador på bladstammarna och stjälkarna.
2) Det skedde en förskjutning av tiden för sena korrosion på potatis - från slutet av juli till början av juli och till och med till slutet av juni.
3) Parningstypen A2, som tidigare saknades i den gamla världen, har blivit allestädes närvarande.
Förändringarna föregicks av två händelser: den massiva användningen av den nya fungiciden metalaxyl (Schwinn och Staub, 1980) och framväxten av Mexiko som en världsexportör av potatis (Niederhauser, 1993). I enlighet med detta framfördes två skäl för befolkningsförändringar: konvertering av parningstyp under påverkan av metalaxyl (Ko, 1994) och massiv introduktion av nya stammar med infekterade knölar från Mexiko (Fry och Goodwin, 1995). Även om omvandlingar av parningstyper under påverkan av metalaxyl erhölls inte bara av Ko utan också i arbeten som utfördes i laboratoriet vid Moskva State University (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), är den andra hypotesen att föredra. Tillsammans med utseendet på den andra typen av parning inträffade allvarliga förändringar i genotyperna av ryska P. infestans-stammar, inklusive i neutrala gener (isozym och RFLP loci), såväl som i strukturen av mitokondrie-DNA. Komplexet av dessa förändringar kan inte förklaras av metalaxyls verkan; snarare var det en massiv import av nya stammar från Mexiko, som, eftersom de var mer aggressiva (Kato et al., 1997), fördrev de gamla stammarna (US-1) och blev dominerande i befolkningen. Förändringen i sammansättningen av europeiska befolkningar skedde på mycket kort tid - från 1980 till 1985 (Fry et al., 1992). På det tidigare Sovjetunionens territorium hittades ”nya stammar” i samlingar från Estland 1985, det vill säga tidigare än i Polen och Tyskland (Goodwin et al., 1994). Förra gången den "gamla stammen US-1" i Ryssland isolerades från en infekterad tomat i Moskva-regionen 1993 (Dolgova et al., 1997). Även i Frankrike hittades ”gamla” stammar i tomatplantningar fram till början av 90-talet, det vill säga efter att de länge hade försvunnit på potatis (Leberton och Andrivon, 1998). Förändringar i P. infestans-stammar påverkade många egenskaper, inklusive de av stor praktisk betydelse, och ökade skadligheten vid senblod.
Sexuell rekombination
För att sexuell rekombination ska bidra till variation, är det nödvändigt, för det första, närvaron av två typer av parning i befolkningen i ett förhållande nära 1: 1, och för det andra närvaron av den ursprungliga befolkningsvariabiliteten.
Förhållandet mellan parningstyper varierar mycket i olika populationer och till och med under olika år i en befolkning (Tabell 9,10, 90). Anledningarna till sådana drastiska förändringar i frekvensen av parningstyper i populationer (som till exempel i Ryssland eller i Israel i början av 2002-talet under förra seklet) är okända, men man tror att det beror på införandet av mer konkurrenskraftiga kloner (Cohen, XNUMX).
Vissa indirekta uppgifter indikerar förloppet av den sexuella processen under vissa år och i vissa regioner:
1) Studier av populationer från Moskva-regionen visade att i 13 populationer där andelen parningstyp A2 var mindre än 10%, var den totala genetiska mångfalden beräknad för tre isozyme loci 0,08 och i 14 populationer där andelen A2 översteg 30% var den genetiska mångfalden dubbelt så hög (0,15) (Elansky et al., 1999). Ju högre sannolikheten för samlag är, desto större är befolkningens genetiska mångfald.
2) Förhållandet mellan förhållandet mellan parningstyper i populationer och intensiteten av bildandet av oospor observerades i Israel (Cohen et al., 1997) och i Holland
(Flier et al., 2004). Våra studier har visat att i populationer där isolat med A2-parningstypen stod för 62, 17, 9 och 6%, hittades oosporer i 78, 50, 30 och 15% av de analyserade potatisbladen (med 2 eller flera fläckar).
Prover med 2 eller fler fläckar hade mycket mer sannolikhet att innehålla oosporer än prover med 1 fläck (32 respektive 14% av proverna) (Apryshko et al., 2004).
Oosporer var mycket vanligare i potatisplantans mellersta och nedre lager (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) I vissa regioner har unika genotyper upptäckts, vars förekomst är förknippad med sexuell rekombination. I Polen 1989 och i Frankrike 1990 stammar således homozygot för glukos-6-
fosfatisomeras (GPI 90/90). Eftersom tidigare endast 10/90 heterozygoter påträffats i 100 år tillskrivs homozygositet sexuell rekombination (Sujkowski et al., 1994). I Colombia (USA) är isolat som kombinerar A2 med GPI 100/110 och A1 med GPI 100/100 vanliga, men i slutet av säsongen 1994 (16 augusti och 9 september) är stammar med rekombinanta genotyper (A1 GPI 100/110 och A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) I vissa populationer från Polen (Sujkowski et al., 1994) och Nordkaukasien (Amatkhanova et al., 2004) motsvarar fördelningen av fingeravtrycks-DNA loci och allozymprotein loci Hardy-Weinberg-fördelningen, vilket indikerar
om den höga andelen av den sexuella rekombinationens bidrag till befolkningens variationer. I andra regioner i Ryssland hittades ingen korrespondens med Hardy-Weinberg-fördelningen i populationer, men närvaron av kopplingsskillnad visades, vilket indikerar övervägande av klonal reproduktion (Elansky et al., 1999).
5) Genetisk mångfald (GST) mellan stammar med olika parningstyper (A1 och A2) var lägre än mellan olika populationer (Sujkowski et al., 1994), vilket indirekt indikerar sexuella korsningar.
Samtidigt kan inte sexuell rekombination bidra till mångfalden i befolkningen. Detta bidrag beräknades för befolkningarna i Moskva-regionen (Elansky et al., 1999). Enligt beräkningarna från Lewontin (1979) blir "rekombination, som kan producera nya varianter från två loci med en frekvens som inte överstiger produkten av deras heterozygositeter, endast om värdena för heterozygositet för båda alleler redan är höga."
Med förhållandet mellan de två typerna av parning, vilket är typiskt för Moskva-regionen, lika med 4: 1, kommer rekombinationsfrekvensen att vara 0,25. Sannolikheten för att korsade stammar kommer att vara heterozygota för två av de tre studerade isozym loci i de studerade populationerna var 0,01 (2 stammar av 177). Därför bör sannolikheten för förekomst av dubbla heterozygoter som ett resultat av rekombination inte överstiga deras produkt multiplicerat med sannolikheten för korsning (0,25x0,02x0,02) = 10-4, dvs. sexuella rekombinanter faller vanligtvis inte in i det studerade provet av stammar. Dessa beräkningar gjordes för befolkningar från Moskva-regionen som kännetecknades av relativt hög variation. I monomorfa populationer som de sibiriska kan den sexuella processen, även om den förekommer i enskilda populationer, inte påverka deras genetiska mångfald.
Dessutom kännetecknas P. infestans av frekvent kromosomavvikelse i meios, vilket leder till aneuploidi (Carter et al., 1999). Sådana kränkningar minskar fertiliteten hos hybriderna.
Parasexuell rekombination, mitotisk genkonvertering
I experiment på fusion av P. infestans-stammar med mutationer av resistens mot olika tillväxtinhibitorer hittades uppkomsten av missolater som var resistenta mot båda inhibitorerna (Shattock och Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Stammar som är resistenta mot två tillväxthämmare uppstod som ett resultat av heterokaryotisering av myceliet, och i detta fall klyvde de sig under reproduktion av mononukleära zoosporer (Judelson, Ge Yang, 1998) eller klyvde inte i monozoosporösa avkommor, eftersom de hade tetraploid (eftersom de första isolaten är diploida) kärnor 1979). Heterozygota diploider segregerade vid en mycket låg frekvens på grund av haploidisering, kromosom icke-sönderdelning och mitotisk korsning (Poedinok et al., 1982). Frekvensen av dessa processer kan ökas med hjälp av vissa åtgärder på heterozygota diploider (till exempel UV-bestrålning av spirande sporer).
Även om bildandet av vegetativa hybrider med dubbel resistens inträffar inte bara in vitro utan också i potatisknölar som är infekterade med en blandning av mutanter (Kulish et al., 1978), är det ganska svårt att bedöma rollen av parasexuell rekombination i genereringen av nya genotyper i populationer. Frekvensen av segregantbildning på grund av haploidisering, icke-upplösning av kromosomer och mitotisk korsning utan specialeffekter är försumbar (mindre än 10-3).
Förekomsten av homozygota segreganter av heterozygota stammar kan baseras på både mitotisk korsning och mitotisk genomvandling, vilket i P. sojae uppträder med en frekvens av 3 x 10-2 till 5 x 10-5 per locus, beroende på stammen (Chamnanpunt et al. , 2001).
Även om förekomsten av heterokaryoner och heterozygota diploider visade sig vara oväntat hög (når tiotals procent), sker denna process endast när mutanta kulturer erhållna från samma stam splitsas. När man använder olika stammar isolerade från naturen sker inte heterokaryotisering (eller sker med mycket låg frekvens) på grund av närvaron av vegetativ inkompatibilitet (Poedinok och Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Följaktligen kan rollen för parasexuell rekombination endast reduceras till intraklonal rekombination i heterozygota kärnor och övergången av enskilda gener till ett homozygot tillstånd utan sexuell process. Denna process kan vara av epidemiologisk betydelse i stammar med recessiva eller semi-dominanta mutationer mot fungicidresistens. Dess övergång till ett homozygot tillstånd på grund av den parasexuella processen kommer att öka motståndet hos bäraren av mutationen (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introduktion av gener
Heterotalliska arter Phytophthora kan interrasera med bildandet av hybridoosporer (se Vorob'eva och Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Den naturliga hybrid av de två Phytophthora-arterna var så aggressiv att den dödade tusentals alar i Storbritannien (Brasier et al., 1999). P. infestans kan förekomma med andra arter av släktet (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, etc.) på vanliga värdväxter och i jorden, men det finns liten information i litteraturen om möjligheten till interspecifika hybrider. Under laboratorieförhållanden erhölls hybrider mellan P. infestans och P. Mirabilis (Goodwin och Fry, 1994).
Tabell 9. Andelen P. infestans-stammar med parningstyp A2 i olika länder i världen under perioden 1990 till 2000 (enligt uppgifterna från källor och webbplatser för öppen litteratur www.euroblight.net, www.eucablight.org)
land | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
belarus | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgien | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estland | 8 (12) | ||||||||||
England | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finland | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Frankrike | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Ungern | 72 (32) | ||||||||||
Irland | 4 (145) | ||||||||||
Norr. Irland | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Nederländerna | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norge | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polen | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Skottland | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Sverige | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Kina | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marocko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexiko (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabell 10. Andelen P. infestans-stammar med A2-parningstyp i olika länder i världen under perioden 2000 till 2011
land | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Österrike | 65 (83) | ||||||||||
belarus | 42 (78) | ||||||||||
Belgien | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Schweiz | 89 (19) | ||||||||||
Tjeckien | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Tyskland | 95 (53) | ||||||||||
Danmark | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estland | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
England | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finland | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Frankrike | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Ungern | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Norr. Irland | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Nederländerna | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norge | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polen | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Skottland | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Sverige | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovakien | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brasilien | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Kina | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dynamik av den genotypiska sammansättningen av populationer
Förändringar i den genotypiska sammansättningen av P. infestans-populationer kan inträffa under påverkan av migration av nya kloner från andra regioner, jordbruksmetoder (förändring av sorter, applicering av fungicider) och väderförhållanden. Externa influenser påverkar olika kloner i olika stadier av livscykeln; därför upplever populationer årligen cykliska förändringar i frekvenser av gener som är selekterade på grund av en förändring i den dominerande rollen som gendrift och selektion.
Påverkan av sorten
Nya sorter med effektiva gener för vertikal resistens (R-gener) är en kraftfull selektiv faktor som väljer kloner med komplementära virulensgener i populationer av P. infestans. I avsaknad av ospecifik resistens i potatisorten, vilket hämmar patogenpopulationens tillväxt, sker processen för att ersätta de dominerande klonerna i populationen mycket snabbt. Efter spridningen av Domodedovsky-sorten i Moskva-regionen, som har R3-resistensgenen, ökade frekvensen av kloner som är virulenta för denna sort från 0,2 till 0,82 på ett år (Dyakov och Derevjagina, 2000).
Ändringen i frekvenserna av virulensgener (patotyper) i populationer sker dock inte bara under påverkan av odlade potatisorter. Till exempel i Vitryssland fram till 1977 dominerade kloner med virulensgenerna 1 och 4, vilket orsakades av odlingen av potatisvarianter med resistensgener R1 och R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). I slutet av 70-talet på XX-talet uppträdde dock kloner med olika virulensgener och deras kombinationer, och de komplementära resistensgenerna användes aldrig i potatisavel (extra virulensgener) (Ivanyuk et al., 2002). Anledningen till uppkomsten av sådana kloner beror tydligen på migrationen av smittsamt material från Mexiko till potatisknölar till Europa. Hemma utvecklades dessa kloner inte bara på odlade potatisar utan också på vilda arter som hade en mängd olika resistensgener; därför var kombinationen av många virulensgener i genomet nödvändig för överlevnad under dessa förhållanden.
När det gäller sorter med ospecifik resistens fördröjer de, genom att minska patogenens reproduktionshastighet, utvecklingen av dess populationer, vilket, som redan nämnts, är en funktion av antalet. Eftersom aggressivitet är polygen, ackumuleras kloner som innehåller ett större antal gener för "aggressivitet" ju tidigare desto högre befolkningsstorlek. Därför är mycket aggressiva raser inte en produkt av anpassning till odlade sorter med ospecifik resistens, utan tvärtom är det mer sannolikt att detekteras i planteringar av mycket mottagliga sorter som är ackumulatorer av parasitsporerna.
Således hittades de mest aggressiva populationerna av P. Infestans i Ryssland i zoner med årliga epifytoties (populationer från Sakhalin, Leningrad och Bryansk regioner). Dessa befolkningars aggressivitet visade sig vara högre än de mexikanska (Filippov et al., 2004).
Dessutom bildas färre oosporer i bladen av resistenta sorter än hos mottagliga (Hanson och Shattock, 1998), det vill säga att den ospecifika resistensen hos sorten också minskar parasitens rekombinationsförmåga och möjligheten till alternativa övervintringsmetoder.
Påverkan av fungicider
Fungicider minskar inte bara antalet fytopatogena svampar, dvs. påverkar de kvantitativa egenskaperna hos deras populationer, men de kan också ändra frekvenserna för enskilda genotyper, dvs. påverka den kvalitativa sammansättningen av befolkningar. Bland de viktigaste indikatorerna för populationer som förändras under påverkan av fungicider är följande: förändringar i resistens mot fungicider, förändringar i aggressivitet och virulens och förändringar i avelssystem.
Inverkan av svampdödande medel på befolkningens resistens och aggressivitet
Graden av denna effekt bestäms först och främst av typen av fungicid som används, som villkorligt kan delas in i polysit, oligosit och monosit.
Den förstnämnda inkluderar de flesta kontaktfungicider. Motstånd mot dem (om det är möjligt alls) styrs av ett stort antal mycket svagt uttrycksfulla gener. Dessa egenskaper bestämmer frånvaron av synliga förändringar i befolkningens resistens efter dess behandling med fungicider (även om i vissa experiment erhölls en viss ökning i resistens). Svamppopulationen som bevaras efter sprutning med kontaktfungicider består av två grupper av stammar:
1) Stammar som bevarats i områden av växter som inte behandlas med läkemedlet. Eftersom det inte fanns någon kontakt med fungiciden, förändras inte dessa stammars aggressivitet och motstånd.
2) Stammar i kontakt med fungiciden, vars koncentration vid kontaktpunkterna var lägre än dödlig. Som nämnts ovan förändras inte motståndet hos denna del av befolkningen emellertid på grund av fungicidens partiella skadliga effekt även i subletal koncentration på svampcellens metabolism, den allmänna konditionen och dess parasitiska komponent, aggressivitet, minskning (Derevyagina och Dyakov, 1990).
Således har även en del av befolkningen som inte har dött, utsatt för kontakt med fungiciden, har en svag aggressivitet och kan inte vara en källa till epifytotika. Därför är noggrann behandling som minskar frekvensen av andelen befolkning som inte är i kontakt med fungiciden ett villkor för att skyddsåtgärder ska lyckas. Resistens mot oligosit fungicider kontrolleras av flera additiva gener.
Mutation av varje gen leder till en viss ökning av resistens, och den totala resistensgraden beror på tillsatsen av sådana mutationer. Därför sker ökningen av motstånd i steg. Ett exempel på en stegvis ökning av resistens är mutationer i resistens mot fungiciddimetomorfen, som ofta används för att skydda potatis från senblod. Dimetomorfresistens är polygen och tillsats. En mutation i ett steg ökar motståndet något.
Varje efterföljande mutation minskar målstorleken och följaktligen frekvensen för efterföljande mutationer (Bagirova et al., 2001). Ökningen av den genomsnittliga resistensen hos befolkningen efter flera behandlingar med oligosit fungicid sker stegvis och gradvis. Hastigheten för denna process bestäms av minst tre faktorer: frekvensen för mutation av resistensgener, resistenskoefficienten (förhållandet mellan den dödliga dosen av en resistent stam i förhållande till en känslig) och effekten av mutationer i resistensgener på kondition.
Förekomsten av varje efterföljande mutation är lägre än den föregående, så processen har en dämpande karaktär (Bagirova et al., 2001). Men om rekombinationsprocesser (sexuella eller parasexuella) förekommer i en population, är det möjligt att kombinera olika föräldramutationer i en hybridstam och påskynda processen. Därför får panmixpopulationer snabbare motstånd än agamiska, och i den senare befolkningar som inte har vegetativa inkompatibilitetsbarriärer snabbare än populationer dividerade med sådana barriärer. I detta avseende accelererar närvaron av stammar i populationer som skiljer sig åt i parningstyperna processen att få resistens mot oligosit-fungicider.
Den andra och tredje faktorn bidrar inte till den snabba ackumuleringen av dimetomorfresistenta stammar i populationer. Varje efterföljande mutation fördubblar ungefär motståndet, vilket är obetydligt, och samtidigt minskar både tillväxttakten i en artificiell miljö och aggressivitet (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Kanske är det därför det finns praktiskt taget inga resistenta stammar bland naturliga P. infestans-stammar, även de som samlats från potatisplantningar behandlade med dimetomorf.
En population som behandlas med en oligosit fungicid kommer också att bestå av två grupper av stammar: de som inte har varit i kontakt med fungiciden och därför inte har förändrat de ursprungliga egenskaperna (om resistenta stammar finns i denna grupp, kommer de inte att ackumuleras på grund av högre aggressivitet och konkurrenskraft hos känsliga stammar), och stammar i kontakt med subletala koncentrationer av fungiciden. Det är bland de senare som det är möjligt att ackumulera resistenta stammar, för här har de fördelar framför känsliga.
Därför, när man använder oligosit fungicider, är det inte så mycket en grundlig behandling som är viktig som en hög koncentration av läkemedlet, flera gånger högre än den dödliga dosen, för med stegvis mutagenes är den initiala resistensen hos muterade stammar låg.
Slutligen är mutationer i resistens mot monosit-fungicider mycket uttrycksfulla, det vill säga en mutation kan rapportera en hög resistensnivå upp till fullständig förlust av känslighet. Därför sker ökningen av befolkningens motstånd mycket snabbt.
Ett exempel på sådana fungicider är fenylamider, inklusive den vanligaste fungiciden metalaxyl. Mutationer av motstånd mot det förekommer med hög frekvens och motståndsgraden hos mutanter är mycket hög - det överskrider den känsliga stammen med en faktor tusen eller mer (Derevyagina et al., 1993). Fastän tillväxthastigheten och aggressiviteten hos resistenta mutanter minskar mot bakgrund av döden av mottagliga stammar från en systemisk fungicid, växer antalet resistenta populationer snabbt och dess aggressivitet ökar parallellt. Därför, efter flera års användning av fungiciden, kan aggressiviteten hos resistenta stammar inte bara motsvara känslighetens aggressivitet utan också överträffa den (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Effekt på sexuell rekombination
Eftersom den frekventa förekomsten av A2-parningstyp i P. infestanspopulationer sammanföll med den intensiva användningen av metalaxyl mot senblåsa föreslogs att metalaxyl inducerar parningstypomvandling. I P. parasitica bevisades en sådan omvandling under inverkan av kloroneb och metalaxyl (Ko, 1994). En enda passage på ett medium med en låg koncentration av metalaxyl ledde till framväxten av homotalliska isolat från en stam av P. infestans känsliga för metalaxyl med parningstyp A1 (Savenkova och Cherepnikova-Anikina, 2002). Under efterföljande passager på media med en högre koncentration av metalaxyl detekterades inte ett enda isolat av A2-parningstyp, men de flesta isolaten, när de korsades med A2-isolat, i stället för oosporer, bildade fula mycelackumuleringar och var sterila. Passager av en resistent stam med A2-parningstyp på media med en hög koncentration av metalaxyl gjorde det möjligt för oss att detektera tre former av parningstypförändringar: 1) fullständig sterilitet när de korsades med A1- och A2-isolat; 2) homotallism (bildandet av oosporer i en monokultur); 3) omvandling av A2-parningstyp till A1. Således kan metalaxyl orsaka förändringar i typerna av parning i populationer av P. infestans och följaktligen sexuell rekombination i dem.
Effekter på vegetativ rekombination
Vissa antibiotikaresistensgener ökade frekvensen för hyphal heterokaryotisering och nukleär diploidisering (Poedinok och Dyakov, 1981). Som nämnts tidigare förekommer heterokaryotisering av hyfer under fusion av olika stammar av P. infestans mycket sällan på grund av fenomenet vegetativ inkompatibilitet i denna svamp. Gener för resistens mot vissa antibiotika kan dock ha biverkningar, uttryckta i att övervinna vegetativ inkompatibilitet. Denna egenskap besattes av 1S-1-mutant streptomycinresistensgenen. Närvaron av sådana mutanter i fältpopulationerna av fytofthora kan öka flödet av gener mellan stammar och påskynda anpassningen av hela befolkningen till nya sorter eller fungicider.
Vissa fungicider och antibiotika kan påverka frekvensen av mitotisk rekombination, vilket också kan förändra genotypfrekvenser i populationer. Den allmänt använda fungiciden benomyl binder till beta-tubulin, ett protein från vilket mikrotubuli i cytoskelettet byggs och stör därigenom processerna för kromosomseparation i mitosens anafas, vilket ökar frekvensen av mitotisk rekombination (Hastie, 1970).
Svampdödande para-fluorfenylalanin, som används för att behandla holländsk sjukdom hos alm, har samma egenskap. Para-fluorfenylalanin ökade rekombinationsfrekvensen i heterozygota diploider P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cykliska förändringar i den genotypiska sammansättningen av populationer i P. infestans livscykel
Den klassiska utvecklingscykeln för P. infestans i den tempererade zonen består av fyra faser.
1) Fas av exponentiell tillväxt av befolkningen (polycyklisk fas) med korta generationer. Denna fas börjar vanligtvis i juli och varar 1,5-2 månader.
2) Fasen för att stoppa befolkningstillväxten på grund av en kraftig minskning av andelen opåverkad vävnad eller uppkomsten av ogynnsamma väderförhållanden. Denna fas i gårdar som utför tidigt avlägsnande av blad före skörd faller ur den årliga cykeln.
3) Övervintringsfasen i knölar, åtföljd av en signifikant minskning av befolkningsstorleken på grund av oavsiktlig infektion av knölar, långsam utveckling av infektion i dem, frånvaron av återinfektion av knölar, ruttnande och nedslagning av drabbade knölar under normala lagringsförhållanden.
4) Fasen av långsam utveckling i mark och på plantor (monocyklisk fas), under vilken produktionstiden kan nå en månad eller mer (i slutet av maj - början av juli). Vanligtvis vid denna tidpunkt är sjuka löv svåra att upptäcka, även med speciella observationer.
Fas av exponentiell befolkningstillväxt (polycyklisk fas)
Många observationer (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) visade att i början av epifytoty dominerar lågvirulenta och lätt aggressiva kloner, som sedan ersätts av mer virulenta och aggressiva. tillväxttakten för befolkningens aggressivitet är ju högre, desto mindre resistent är värdväxtens variation.
När befolkningen växer ökar koncentrationen av både selektivt viktiga gener som introduceras i kommersiella sorter (R1-R4) och selektivt neutral (R5-R11). I populationerna nära Moskva 1993 ökade den genomsnittliga virulensen från slutet av juli till mitten av augusti från 8,2 till 9,4, och den största ökningen observerades för den selektiva neutrala virulensgenen R5 (från 31 till 86% av virulenta kloner) (Smirnov, 1996 ).
En minskning av befolkningens tillväxttakt åtföljs av en minskning av befolkningens parasitiska aktivitet. Därför, under depressiva år, är både det totala antalet raser och andelen mycket virulenta raser lägre än hos epifytotiska (Borisenok, 1969). Om på höjden av epifytotiska väderförhållanden ändras till ogynnsamt för senblod och potatisinfektioner minskar minskar också koncentrationen av mycket virulenta och aggressiva kloner (Rybakova et al., 1987).
Ökningen av frekvenser av gener som påverkar populationens virulens och aggressivitet kan bero på valet av mer virulenta och aggressiva kloner i den blandade populationen. För att demonstrera valet utvecklades en metod för analys av neutrala mutationer, som framgångsrikt användes i kemostatpopulationer av jäst (Adams et al., 1985) och Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Frekvensen av mutanter som är resistenta mot blasticidin S i fältpopulationen hos P. infestans minskade parallellt med tillväxten i aggressiviteten hos befolkningen, vilket indikerar en förändring i de dominerande klonerna i processen för befolkningstillväxt (Rybakova et al., 1987).
Övervintringsfas i knölar
Under vintern i potatisknölar minskar virulens och aggressivitet hos P. infestans-stammar, och minskningen av virulens sker långsammare än aggressivitet (Rybakova och Dyakov, 1990). Uppenbarligen är "extra" virulensgener och hög aggressivitet användbara under förhållanden som bidrar till den snabba tillväxten av befolkningsstorleken (r-selektion), varför utvecklingen av epytofytika åtföljs av valet av de mest virulenta och aggressiva klonerna. Under förhållanden med mättnad av miljön, när inte reproduktionshastigheten, men ihållande existens under ogynnsamma förhållanden (K-selektion) spelar en viktig roll, "extra" gener av virulens och aggressivitet minskar konditionen, och kloner med dessa gener är de första som dör ut, så att genomsnittlig aggressivitet och befolkningens virulens minskar.
Vegetationsfas i jord
Denna fas är den mest mystiska i livscykeln (Andrivon, 1995). Dess existens postuleras rent spekulativt - på grund av bristen på information om vad som händer med patogenen under en lång period (ibland mer än en månad) - från uppkomsten av potatisplantor till uppkomsten av de första fläckarna av sjukdomen på dem. På grundval av observationer och experiment rekonstruerades svampens beteende under denna livstid (Hirst och Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulering av svampen kan bildas på infekterade knölar i jorden. De resulterande sporerna spirar med hyfer, som kan vegetera under lång tid i jorden. Primära (bildade på knölar) och sekundära (på myceliet i jorden) sporer stiger till markytan med kapillärströmmar, men får förmågan att infektera potatis först efter att dess nedre löv faller ner och kommer i kontakt med markytan. Sådana löv (nämligen de första fläckarna av sjukdomen finns på dem) bildas inte omedelbart utan efter långvarig tillväxt och utveckling av potatistoppar.
Således kan den saprotrofa vegetationsfasen också existera i P. infestans livscykel. Om aggressivitet i den parasitiska fasen av livscykeln är den viktigaste komponenten av konditionen, är syftet med den saprotrofiska fasen att minska parasitegenskaperna, vilket har visats experimentellt för vissa fytopatogena svampar (se Carson, 1993). Därför bör aggressiva egenskaper i denna fas av cykeln gå förlorade mest intensivt. Men hittills har inga direkta experiment utförts för att bekräfta ovanstående antaganden.
Säsongsförändringar påverkar inte bara de patogena egenskaperna hos P. infestans utan också motståndet mot fungicider, som växer i polycyklisk fas (under epytofotier) och minskar under vinterförvaring (Derevyagina et al., 1991; Kadish och Cohen, 1992). En särskilt intensiv nedgång i resistens mot metalaxyl observerades mellan planteringen av de drabbade knölarna och uppkomsten av de första fläckarna av sjukdomen i fältet.
Intraspecifik specialisering och dess utveckling
P. infestans orsakar epidemier i två kommersiellt viktiga grödor, potatis och tomat. Epifytoties på potatis började strax efter att svampen kom in i nya områden. Tomatens nederlag noterades också strax efter infektion på potatis, men epifytoties på tomat noterades bara hundra år senare - i mitten av XNUMX-talet. Här är vad Hallegli och Niederhauser skriver om tomats nederlag i USA
(1962): ”I cirka 100 år efter den svåra epifytotin 1845 gjordes få eller nästan inga försök att få resistenta sorter av tomat. Även om senblod först registrerades på tomater så tidigt som 1848, blev det inte föremål för allvarlig uppmärksamhet hos uppfödare på denna växt förrän ett starkt utbrott av sjukdomen 1946. På Rysslands territorium registrerades sen skada av tomat på 60-talet. ”Under lång tid var forskarna inte uppmärksamma på denna sjukdom, eftersom den inte orsakade någon betydande ekonomisk skada. Men på 70- och 1979-talet. XX-talets epifytotier av sen skada på tomat observeras också i Sovjetunionen, främst i Nedre Volga-regionen, i Ukraina, Nordkaukasien, i Moldavien ... ”(Balashova, XNUMX).
Sedan dess har tomatskador med senblod blivit ettåriga, har spridit sig över hela territoriet för industriell och hemodling och orsakar enorm ekonomisk skada på denna gröda. Vad hände? Varför inträffade parasitens första utseende på potatis och epifytotisk skada av denna gröda nästan samtidigt, och varför tog det ett sekel för epifytotiken att dyka upp på tomaten? Dessa skillnader stöder en mexikansk snarare än en sydamerikansk infektionskälla. Om arten Phytophthora infestans bildades som en parasit av mexikanska knölbärande arter av släktet Solanum, är det förståeligt varför odlade potatis som tillhör samma del av släktet som den mexikanska arten påverkades så starkt, men på grund av frånvaron av coevolution med parasiten, som inte utvecklade mekanismer för specifik och ospecifik resistens.
Tomat tillhör en annan sektion av släktet, typ av utbyte har betydande skillnader från knölart, därför att tomaten inte är utanför P. infestans livsmedelsspecialisering var skadans intensitet otillräcklig för allvarliga ekonomiska förluster.
Framväxten av epifytoties på en tomat beror på allvarliga genetiska förändringar i parasiten, vilket ökade dess kondition (patogenicitet) under parasitism. Vi tror att den nya formen specialiserad för parasitisering av tomaten är T1-loppet som beskrivs av M. Gallegly, som påverkar sorter av körsbärstomat (Red Cherry, Ottawa), som är resistent mot T0-loppet som är utbrett på potatis (Gallegly, 1952). Tydligen en mutation (eller en serie av mutationer) som förvandlade T0-loppet till T1-loppet och ledde till framväxten av kloner som var mycket anpassade för att besegra tomat. Som ofta händer åtföljdes en ökning av patogeniciteten för en värd av en minskning av den till en annan, det vill säga en initial, ännu inte fullständig intraspecifik specialisering uppstod - till potatis (race T0) och till tomat (race T1).
Vad är beviset för detta antagande?
- Förekomst på potatis och tomater. På tomatblad dominerar T1-loppet, medan det på potatisblad är sällsynt. Enligt S.F. Bagirova och T.A. Oreshonkova (opublicerat) i Moskva-regionen 1991-1992 var förekomsten av T1-loppet i potatisplantager 0% och i tomatplantager - 100%; 1993-1995 - 33% respektive 90%; 2001 - 0% och 67%. Liknande data erhölls i Israel (Cohen, 2002). Experiment med infektion av potatisknölar med isolat från T1-loppet och en blandning av isolat T0 och T1 visade att isolat från T1-loppet är dåligt bevarade i knölar och ersätts av isolat från T0-loppet (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamik hos ras T1 i tomatplanteringar. Den primära infektionen av tomatblad utförs av isolat från T0-loppet, som dominerar i analysen av infektion i de första fläckarna som bildas på bladen. Detta bekräftar det allmänt accepterade schemat för parasitmigrationen: Huvudmassan för infektion från potatis görs av T0-loppet, men ett litet antal T1-kloner bevarade i potatis, en gång på tomaten, förskjuter T0-loppet och ackumuleras mot slutet av den epifytotiska perioden. Det är också möjligt att det finns en alternativ källa till tomatbladinfektion med T1-loppet, som inte är lika kraftfull som potatisknölar och löv, men konstant. Därför har denna källa en svag effekt på den genetiska strukturen hos befolkningen som infekterar tomat, men bestämmer därefter ackumuleringen av T1-loppet (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Aggressivitet för potatis och tomater. Konstgjord infektion av tomat- och potatisblad med isolat från raserna T0 och T1 visade att de förstnämnda är mer aggressiva för potatis än för tomat, och de senare är mer aggressiva för tomat än för potatis. Dessa skillnader manifesteras i förskjutningen av isolat från en icke- "egen" ras från en blandad befolkning under lövpassager i ett växthus (D'yakov et al., 1975) och i fält tomter (Leberton et al., 1999); skillnader i minsta infektiösa belastning, latensperiod, storlek på infektiösa fläckar och sporproduktion (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
Aggressiviteten hos isolat från T1-loppet till tomatkultivar som saknar resistensgener är så hög att dessa isolat sporer på löv som på ett näringsmedium utan att nekrotisera den infekterade vävnaden (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulens för potatis och tomater. T1-loppet påverkar körsbärstomatsorter med Ph1-resistensgenen, medan T0-loppet inte kan infektera dessa sorter, dvs. har en smalare virulens. I förhållande till differentierare
Potatisns R-gener är omvänt besläktade, d.v.s. stammar isolerade från tomatblad är mindre virulenta än "potatis" -stammar (tabell 11).
5) Neutrala markörer. Analysen av neutrala markörer i populationerna av P. infestans som parasiterar på potatis och tomater vittnar också om det multidirektionella intraspecifika urvalet. I de brasilianska populationerna av P. infestans tillhörde tomatbladisolat den klonala linjen US-1, och de från potatisblad tillhörde BR-1-linjen (Suassuna et al., 2004). I Florida (USA), sedan 1994, började klon US-90 dominera på potatis (med en förekomst på mer än 8%) och kloner US-11 och US-17 på tomat, och den senare isolaten är mer aggressiv för tomat än för potatis (Weingartner , Tombolato, 2004). Betydande skillnader i genotypfrekvenser (DNA-fingeravtryck) i potatis- och tomatisolat fastställdes för 1200 P. infestans-stammar uppsamlade i USA från 1989 till 1995 (Deahl et al., 1995).
Genom att använda AFLP-metoden var det möjligt att separera 74 stammar som samlats in från potatis- och tomatblad 1996-1997. i Frankrike och Schweiz, i sju grupper. Potatis- och tomatstammarna skilde sig inte helt klart, men "potatis" -stammarna var genetiskt mer olika än de "tomat". De förstnämnda hittades i alla sju kluster, och de senare bara i fyra, vilket indikerar ett mer specialiserat genom av det senare (Knapova och Gisi, 7).
6) Isoleringsmekanismer. Om parasitpopulationerna på två värdväxtarter utvecklas mot att begränsa specialiseringen till sin ”egen” värd, uppstår olika pre- och postmeiotiska mekanismer som förhindrar interpopulation genetiskt utbyte (Dyakov och Lekomtseva, 1984).
Flera studier har undersökt effekten av källan till föräldrastammar på effektiviteten av hybridisering. När stammar isolerade från olika arter av släktet Solanum korsades i Ecuador (Oliva et al., 2002) fann man att stammar med parningstypen A2 från vilda nattskuggor (klonlinje EC-2) korsade det värsta med stammar från tomat (linje EC -3) och korsades mest effektivt med potatisstammen (EC-1).
Alla hybrider befanns vara icke-patogena. Författarna tror att den låga andelen hybridisering och minskningen av patogenicitet i hybrider beror på postmeiotiska mekanismer för reproduktiv isolering av populationer.
I experimenten från Bagirova et al. (1998) korsades ett stort antal potatis- och tomatstammar med egenskaperna hos T0- och T1-loppet. De mest bördiga korsningarna av T1xT1-stammar som isolerats från tomat (36 oosporer i mikroskopets synfält, 44% av oosporens spiring), de minst effektiva var korsningar av T0xT1-raser isolerade från olika värdar (ett lågt antal utvecklande och grodda oosporer, en hög andel aborterade och underutvecklade oosporer) ... Effektiviteten för korsningar mellan isolat från T0-loppet som isolerats från potatis var mellanliggande. Eftersom huvuddelen av stammar från T0-loppet påverkar potatis har den en pålitlig källa till övervintring - potatisknölar, vilket gör att oosporernas betydelse som övervintrande smittsamma enheter för potatispopulationer är låg. Den anpassade "tomatformen" kan övervintra på tomaten i form av oosporer (se nedan) och bibehåller därför en högre produktivitet i den sexuella processen. På grund av sin höga fertilitet förvärvar T1 en oberoende potential för primär infektion i tomat. De resultat som erhållits av Knapova et al. (Knapova et al., 2002) kan tolkas på samma sätt. Korsningarna av stammar isolerade från potatis med stammar från tomat gav det högsta antalet oosporer - 13,8 per kvm. medium (med en spridning av 5-19) och en mellanliggande procent av groning av oosporer (6,3 med en spridning av 0-24). Korsningar av stammar isolerade från tomat gav den lägsta andelen oosporer (7,6 med en spridning av 4-12) med den högsta andelen av deras grobarhet (10,8). Korsningarna mellan de stammar som isolerats från potatis gav ett mellanliggande antal oosporer (8,6 med en hög spridning av data - 0-30) och den lägsta andelen spiring av oosporer (2,7). Således är stammar från potatis mindre bördiga än de från tomat, men interpopulationskors gav inte sämre resultat än intrapopulation. Det är möjligt att skillnaderna med ovanstående data av Bagirova et al. förklaras av det faktum att ryska forskare arbetade med stammar isolerade i början av 90-talet av 90-talet, och schweiziska forskare - med stammar isolerade i slutet av XNUMX-talet.
Grunden för låg fertilitet kan vara heteroploidin hos stammarna. Om i mexikanska populationer, där den sexuella processen och den primära infektionen med oosporavkomma är regelbundna, observeras de flesta av de studerade stammarna av P. Infestans diploida, så observeras i de gamla världens länder polymorfism av ploidi inom befolkningen (di-, tri- och tetraploida stammar, liksom heterokaryota stammar med heteroploida kärnor) och stammar som har olika typer av parning, dvs. ömsesidigt bördiga, skiljer sig åt i kärnploidi (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Mångfalden av kärnor i antheridia och oogonia kan vara orsaken till låg fertilitet.
När det gäller kärnutbyte mellan hyfer under anastomoser förhindras detta av vegetativ inkompatibilitet, som delar aseksuella populationer i många genetiskt isolerade kloner (Poedinok och Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Konvergens av befolkningar. Ovanstående data indikerar att hybridisering mellan "potatis" och "tomat" P. infestans-stammar är möjlig. Ömsesidig återinfektion av olika värdar är också möjlig, om än med minskad aggressivitet.
En studie av populationsmarkörer i isolat från intilliggande potatis- och tomatfält 1993 visade att ungefär en fjärdedel av isolaten isolerade från tomatblad överfördes från ett närliggande potatisfält (Dolgova et al., 1997). Teoretiskt kan man anta att skillnaderna hos populationer på två värdar skulle öka och leda till framväxten av specialiserade intraspecifika former (f.sp. potatis och f.sp. tomat), särskilt eftersom oosporer kan kvarstå i växtrester (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) och tomatfrön (Rubin et al., 2001). Följaktligen har tomater för närvarande en källa till vårförnyelse oberoende av potatisknölar.
Men allt hände annorlunda. Övervintring med oosporer gjorde det möjligt för parasiten att undvika det smalaste stadiet i dess livscykel - det monocykliska vegetationsstadiet i jorden, under vilket parasitiska egenskaper minskar, som gradvis återställs i den polycykliska fasen på sommaren.
Tabell 11. Frekvenser av virulensgener till potatisdifferentieringssorter i P. infestans-stammar
land | År | Genomsnittligt antal virulensgener i stammar | Författare | |
från potatis | från tomat | |||
Frankrike | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Frankrike, Schweiz | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
USA | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
USA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Ryssland, Mosk. område | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Ryssland, olika regioner | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya och andra. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primär zoosporangia och zoosporer, som groddar oosporer, har en hög grad av parasitaktivitet, särskilt om oosporer bildades parthenogenetiskt under påverkan av feromoner av en stam med motsatt typ av parning. Därför är det smittsamma materialet på tomatplantor som odlas från frön infekterade med oosporer mycket patogent för både tomat och potatis.
Dessa förändringar ledde till en ny omstrukturering av befolkningen, uttryckt i följande viktiga förändringar ur epidemiologisk synvinkel:
- Infekterade tomatplantor har blivit en viktig källa till primärinfektion av potatis (Filippov, Ivanyuk, personliga meddelanden).
- Epifytoties på potatis började observeras redan i juni, ungefär en månad tidigare än vanligt.
- I potatisplantningar ökade andelen T1-lopp, vilket tidigare hittades där i obetydlig mängd (Ulanova et al., 2003).
- Stammar isolerade från tomatblad skilde sig inte längre från potatisstammar i virulens på potatisdifferentierare av virulensgener och började överträffa "potatis" -stammar i aggressivitet, inte bara på tomat utan även på potatis (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. 2003).
Således, istället för divergens, fanns en konvergens av populationer, framväxten av en enda population på två värdväxter med hög virulens och aggressivitet för båda arterna.
Slutsats
Så, trots mer än 150 års intensiv studie av P. infestans, är biologi, inklusive befolkningsbiologin hos detta orsakande medel för de viktigaste sjukdomarna hos odlade solanaceous växter, fortfarande mycket okänt. Det är inte klart hur passagen av enskilda stadier av livscykeln påverkar befolkningens struktur, vilka genetiska mekanismer är kanaliserad variation av aggressivitet och virulens, vad är förhållandet mellan de reproduktiva och klonala reproduktionssystemen i naturliga populationer, hur vegetativ inkompatibilitet ärvs, vilken roll potatis och tomater har i den primära infektionen av dessa grödor och i vad är deras effekt på strukturen hos parasitpopulationer. Hittills har sådana viktiga praktiska frågor som de genetiska mekanismerna för att ändra parasitens aggressivitet eller erosion av ospecifik potatisresistens inte lösts. Med fördjupningen och utvidgningen av forskningen kring sen potatis, skapar parasiten nya utmaningar för forskare. Förbättringen av experimentella förmågor, framväxten av nya metodologiska metoder för manipulation med gener och proteiner gör det dock möjligt för oss att hoppas på en framgångsrik lösning på de frågor som ställs.
Artikeln publicerades i tidskriften "Potato Protection" (nr 3, 2017)