D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Den fytopatogena svampen Colletotrichum coccodes orsakar farliga sjukdomar i potatis och tomater som kallas antracnos och knölsvarta fläckar. Med morfologiska egenskaper är de ofta svåra att skilja från sjukdomar orsakade av andra mikroorganismer. på gröna tomatfrukter kan sjukdomen vara asymptomatisk och manifesteras endast på mogna röda frukter. För snabb och korrekt diagnos av patogenen erbjuds ett PCR-testsystem i realtid. För att utveckla ett testsystem bestämdes nukleotidsekvensen för glyceroltrifosfatdehydrogenasgenen från 45 C. coccodes-stammar isolerade från potatisknölar i olika regioner i Ryssland.
Baserat på de erhållna resultaten och analysen av liknande sekvenser av andra arter som finns tillgängliga i GenBank-databasen, utformades artsspecifika primers och prober för C. coccodes. För att kontrollera specificiteten hos det skapade testsystemet utfördes PCR med DNA isolerat från rena kulturer av 15 olika arter av parasitiska och saprotrofiska svampar associerade med tomat- och potatisväxter (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Närvaron av Colletotrichum coccodes DNA bestämdes vid en tröskelcykel på 20–27, medan andra arter detekterades efter 40 cykler eller detekterades inte. Testsystemet gör det möjligt att pålitligt detektera C. coccodes DNA-koncentrationer över 0.01 ng / mm3 i den analyserade PCR-blandningen. Med hjälp av det utvecklade testsystemet undersöktes närvaron av C. coccodes i tomatblad med symtom på svampsjukdomar och i potatisknölar utan yttre symtom på sjukdomen. Löv med symtom på svampinfektion samlades från två olika fält i Krasnodar-territoriet, knölar - från fält i Kostroma, Moskva, Kaluga, Nizhny Novgorod-regionerna. Ett tomatblad innehållande C. coccodes DNA hittades i Krasnodar Territory; en signifikant närvaro av DNA hos denna patogen detekterades i 5 prover av knölar som odlats i Kostroma, Moskva, Kaluga-regionerna.
Inledning
Svampar av släktet Colletotrichum är farliga fytopatogener som påverkar spannmål, grönsaker, örter, fleråriga frukt- och bärväxter. En av de allestädes närvarande arterna i detta släkt, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, är det orsakande medlet för antraknos och svart fläck av potatis och tomater och orsakar sjukdomar hos ett antal andra växter i familjen Solanaceae, inkl. ogräs (Dillard, 1992). C. coccodes infekterar alla underjordiska delar av växten, stambasar, löv och frukter (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). På skalet av infekterade potatisknölar observeras utvecklingen av grå fläckar med otydligt uttalade kanter, på vilka svarta fläckar av sporulering och mikroskleroti syns tydligt. Under lagring kan sår med mjukt innehåll bildas i knölens massa, dvs. sjukdomen går in i antraknosfasen, vilket dock är extremt sällsynt.
Samtidigt är symtomen på antraknos (hudsår med små svarta prickar) typiska för tomatfrukter. På löv visas symtomen på C. coccodes som mörkbruna fläckar, vanligtvis kantade av gul vävnad (Johnson, 1994).
Utvecklingen av svart fläck på knölarna förstör deras utseende, vilket är särskilt uttalat när man säljer tvättade rödskalspotatis. Peel-peeling leder till överdriven avdunstning och ökade lagringsförluster (Hunger, McIntyre, 1979). Skador på andra växtorgan leder till avkastningsförluster, vilket noterades i både öppen och sluten mark (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Sjukdomar orsakade av C. coccodes är vanliga i nästan alla potatisproducerande regioner i världen, inklusive Ryssland (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrollen av dessa sjukdomar är svår på grund av att befintliga fungicider är otillräckliga mot C. coccodes och bristen på resistenta sorter (Read, Hide, 1995).
C. coccodes-inokulatet kan kvarstå i fröknölar (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tomatfrön (Ben-Daniel et al., 2010), överlever länge i jord, på växtrester (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) och i ogräs (Raid, Pennypacker, 1987). Ett antal författares verk (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) har visat att sjukdomsutvecklingen hos potatis och tomater till stor del beror på förekomsten av inokulum i utsäde och jord. För att minimera förluster från sjukdomen är det därför nödvändigt att diagnostisera (inklusive kvantitativa) utbredningen av svampen i utsädesmaterialet, i jorden, i utsädespotatisknölarna och tomatfrön som lagts för lagring. Morfologisk diagnostik i mark och växtmaterial kan endast utföras genom närvaro av mikroskleroti, som emellertid också finns i andra typer av svampar.
Symtomen på knölarna liknar den silverfärgade skorpan som orsakas av svampen Helminthosporium solani. Isolering av Colletotrichum coccodes och Helminthosporium solani till en ren kultur är ganska svår och tar lång tid på grund av den långsamma tillväxten på ett näringsmedium. För att snabbt identifiera Colletotrichum-koder är det nödvändigt att använda instrumentella diagnostiska metoder. Den mest praktiska metoden är polymeraskedjereaktion (PCR) och dess modifiering - PCR i realtid. För närvarande används ett testsystem utvecklat av brittiska forskare (Cullen et al., 2002) för ITS1-regionen i rDNA i Europa och USA. Dess användning har visat bra resultat i analysen av ryska isolat (Belov et al, 2018). C. coccodes är dock mycket varierande och dess detektering från en enda DNA-sekvens kan leda till falskt negativa resultat. För en mer tillförlitlig diagnos krävs analys för flera artsspecifika DNA-sekvenser, i samband med vilka vi har utvecklat ett originellt testsystem som gör det möjligt att identifiera C. coccodes genom sekvensen för glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenasgenen.
Material och metoder
För att bedöma effektiviteten och specificiteten hos de skapade testsystemen använde vi rena kulturer av 15 svamparter som isolerats av författarna från sjuka prover av tomatblad och frukt, potatisknölar (tabell 1). För isolering togs växternas organ med symtom på svampinfektion, inte mer än ett organ per buske.
En bit knöl med en skal, en skiva tomatfrukt och ett drabbat blad placerades under ett kikarmikroskop, varefter mycel, sporer eller en bit vävnad överfördes till ett agarmedium (wortagar) i en petriskål med en slipad dissektionsnål. Isolaten lagrades i agarlutning i provrör vid 4 ° C.
Prover av tomatblad med symtom på svampsjukdomar, avsedda för analys, omedelbart efter uppsamling (i fältet) placerades i 70% etylalkohol där de lagrades tills DNA-isolering. Potatisknölar levererades till laboratoriet, skalades (2 × 1 cm bit) från dem och frystes vid -20 ° C. Lagras frysta tills DNA-isolering.
Rena odlingar av svampar för DNA-isolering odlades i flytande ärtmedium. Svampens mycel avlägsnades från det flytande mediet, torkades på filterpapper, frystes i flytande kväve, homogeniserades, inkuberades i CTAB-buffert, renades med kloroform, fälldes ut med en blandning av isopropanol och 0.5 M kaliumacetat, tvättades två gånger med 2% alkohol. Resulterande DNA löstes i avjoniserat vatten och lagrades vid –70 ° С (Kutuzova et al., 20). DNA-koncentration mättes med användning av ett HS-DNA-kvantifieringssats för dubbelsträngat DNA på Qubit 2017 (Qiagen, Tyskland). De alkoholiserade och frysta proverna triturerades i flytande kväve, därefter utfördes DNA-extraktion såsom beskrivits ovan (för myceliet av rena svampkulturer).
Tabell 1. De använda svampstammarnas ursprung
Svampnamn | Växt, organ | Plats för val |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | potatisknöl | Kostroma-regionen, potatisknölar av den första åkergenerationen, sorten Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | potatisblad | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | potatisknöl | Magadan-regionen, pos. Tält, potatisknöl |
Cladosporium fulvum | tomatblad | Moskva-regionen, storfruktad tomat |
Alternaria tomatophila | tomatfrukt | inlämnad av personalen vid laboratoriet för mykologi och fytopatologi vid All-Russian Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomatfrukt | Krasnodar-territoriet, Krymsky-distriktet, klass Cream |
Fusarium oxysporum | vete rot | Moskva regionen |
PCR utfördes på en DTprime-förstärkare (DNA-Technology). För PCR användes ursprungliga grundfärger och en sond för den artsspecifika regionen av glyceroltrifosfatdehydrogenasgenen: främre primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, omvänd primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Primrarna förstärker en 213 bp-region.
Reaktionen tog 50 ng totalt DNA (vid analys av löv och knölar) och 10 ng (vid analys av DNA från rena svampkulturer). Reaktionsblandningen (35 | il) separerades av ett paraffinskikt i två delar: den nedre (20 | il) innehöll 2 | il 10 × reaktionsbuffert (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM av varje deoxinukleotidtrifosfat, 7 pmol av varje primer och 4 pmol av en hydrolyserbar fluorescerande sond; den övre innehöll 1 | il 10 × PCR-buffert och 1 U Taq-polymeras.
Separation av blandningen med paraffin gör att rören kan förvaras under en lång tid vid en temperatur av 5 ° C och för att ge en varmstart för PCR efter upphettning i 10 minuter vid en temperatur över 80 ° C. PCR utfördes enligt följande program: 94.0 ° C - 90 s (1 cykel); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cykler); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cykler); 10.0 ° C - lagring.
resultat och diskussion
Sekvenserna för glyceroltrifosfatdehydrogenasgenen bestämdes i 45 stammar isolerade från löv, stjälkar, potatisknölar och tomatfrukter (Kutuzova, 2018) i olika regioner i Ryssland. De studerade sekvenserna för alla stammar uppdelades i två grupper som skilde sig åt i två nukleotider. Nukleotidsekvenserna för representanter för båda grupperna under numren KY2 och KY496634 deponeras i GenBank.
Primers coc70gdf, coc280gdr och cocgdz-sonden designad på deras bas kontrollerades med BLAST-programmet (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) på alla sekvenser av glyceroltrifosfatdehydrogenasgenen från arter av släktet Colletotrichum och andra organismer tillgängliga i GenBank-databasen.
Inga DNA-regioner i andra organismer som var mycket homologa med primrar och sond hittades.
Testsystemets känslighet kontrollerades med hjälp av prover med olika koncentrationer av C. coccodes DNA, DNA från ett potatisblad infekterat med antraknos (samlades 2017 i Mari El, sort Red Scarlett) och skal av knölar som drabbats av svart fläck (samlad i Kostroma-regionen sort Red Scarlett, tabell 2). För att bekräfta närvaron av DNA i knölar och potatisblad isolerades C. coccodes-stammar från dem i rena kulturer.
Resultaten av testsystemets känslighetsanalys visar att det kan användas för att framgångsrikt diagnostisera närvaron av C. coccodes DNA i ett prov om dess totala innehåll i PCR-blandningen är mer än 0.05 ng. Detta är tillräckligt för detektion, eftersom en sclerotia innehåller i genomsnitt 0.131 ng, och en spore innehåller cirka 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Testsystemet utvecklat av den engelska gruppen (Cullen et al., 2002) visade en liknande känslighet (tröskelcykel 34 vid 0.05 ng DNA och 37 vid 0.005 ng).
Analys av naturliga prover innehållande C. coccodes gjorde det i alla fall möjligt att på ett tillförlitligt sätt avslöja dess närvaro i provet (tabell 2). Den föreslagna metoden för DNA-isolering var också tillämplig på analysen av naturliga växtprover.
Tabell 2. Bestämning av känsligheten hos det föreslagna testsystemet för identifiering av Colletotrichum-koder för realtids-PCR
prov | DNA-mängd i prov *, ng | Tröskelcykel | C. detektering av coccodes |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Knölskal 1 | 50 | 32 | + |
Knölskal 2 | 50 | 30 | + |
Knölskal 3 | 50 | 31.5 | + |
Potatisblad | 50 | 29.5 | + |
Notera. * I en blandning av PCR-produkter.
Testsystemets specificitet testades på DNA-prover extraherade från 15 svamparter. Alla svampstammar isolerades av författarna från drabbade och friska frukter och blad av tomat, potatisknölar; en stam isolerades från veteroten (tabell 1). Bland de arter som är isolerade från fruktens yta finns det också arter som inte är patogena för tomat (till exempel Phellinus ferrugineovelutinus).
Studier har visat att C. coccodes DNA detekterades vid en tröskelcykel på 20–27, medan andra svamparter inte detekterades eller gav en signal efter cykel 40, vilket kan hänföras till en ospecifik bruseffekt (tabell 3).
Tabell 3. Kontroll av testsystemet för olika typer av svamp
Svampnamn | Tröskelcykel |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. coccoder 2 | 22.6 |
C. coccoder 3 | 23 |
C. coccoder 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Notera. * Mängden DNA i alla prover var 10 ng.
Det utvecklade testsystemet användes för att identifiera C. coccodes i tomatbladprover med symtom på nekrotrofiska patogener och utsäde potatisknölar utan synliga symtom. För studien tog vi fröknölar av olika sorter som odlats i regionerna Kostroma, Moskva, Kaluga, Nizhny Novgorod. Närvaron av C. coccodes-DNA ansågs vara signifikant i proverna, vid analysen av vilken tröskelcykeln inte översteg 35. Detta tröskelvärde valdes baserat på tillförlitlig bestämning av 0.05 ng C. coccodes-DNA (tröskelcykel 33.5, tabell 2) och det faktum att tröskelcykler över 40 diagnostiserades icke-specifikt DNA från vissa andra svamparter. Med detta tillvägagångssätt detekterades den betydande närvaron av C. coccodes DNA i 5 prover av knölar som odlats i Kostroma, Moskva, Kaluga-regionerna och i ett tomatblad från Yeisk-distriktet i Krasnodar-regionen (Tabeller 4, 5).
Tabell 4. Detektering av Colletotrichum-koder på potatisknölar *
Provnummer | Många potatisar | Plats för tillväxt | C. detektering av coccodes | Tröskelcykel |
---|---|---|---|---|
1 | Red Scarlet | Kostroma region | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskva regionen | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky tidigt | Moskva regionen | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga region. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasi | Kaluga region. | - | |
15 | gala | Nizhny Novgorod-regionen. | - | |
16 | - |
Notera. * Mängden DNA i alla prover var 50 ng.
Tabell 5. Detektion av Colletotrichum-koder på tomatblad *
Provnummer | Plats för tillväxt | C. detektering av coccodes | Tröskelcykel |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar-territoriet, Krim-distriktet | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar-territoriet, Yeisk-distriktet | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Mängden DNA i alla prover var 50 ng.
Det testsystem som vi skapat är inte sämre än det som utvecklats av brittiska forskare (Cullen et al., 2002) vad gäller känslighet och specificitet och är lämpligt för analys av växtprover. Dess tillämpning för analys av fröknölar gjorde det möjligt att identifiera C. coccodes DNA i knölar utan yttre tecken på skada och att framgångsrikt analysera infektion av löv.
Hittills har ingen analys av potatisknölar för angrepp av C. coccodes utförts i Ryssland. Vår första studie visade att av 16 testade fröknölar som odlats i olika regioner i Ryssland innehåller 5 C. coccodes. Detta visar att den svarta fläcken av potatisknölar är en vanlig potatissjukdom i Ryssland, och dess roll för att minska volymen och kvaliteten på potatisgrödan underskattas.
Analys av tomatblad avslöjade en betydande närvaro av C. coccodes DNA i ett blad från Yeisk-distriktet i Krasnodar Territory. Tidigare, när man undersökte tomatfält i södra Ryssland med användning av det brittiska testsystemet (Cullen et al., 2002), hittades löv innehållande C. coccodes och i vissa fält hittades en hög andel blad infekterade med C. coccodes (Belov et al., 2018). I Krasnodar- och Primorsky-territorierna, Moskva-regionen, hittade vi tomatfrukter, från vilka vi lyckades isolera rena kulturer av C. coccodes. Det är möjligt att C. coccodes är mycket mer utbredd på tomat i Ryssland än vad man nu tror, och dess skadlighet underskattas också.
Hittills har sålunda tillräckligt med information ackumulerats om den utbredda distributionen av C. coccodes på potatis och tomater.
För att bättre förstå denna svamps roll i utvecklingen av potatis- och tomatsjukdomar är det nödvändigt att övervaka dess förekomst i Ryssland, studera jord- och fröinfektions roll och svartfläckens roll i förluster under lagring. Användningen av PCR-diagnostik kan underlätta detta arbete avsevärt, och samtidig användning av båda testsystemen kommer att öka analysens noggrannhet avsevärt.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från ryska vetenskapsstiftelsen nr 18-76-00009.
Artikeln publicerades i tidskriften "Mycology and Phytopathology" (volym 54, nr 1, 2020).