ÄTA. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Det har nyligen visats att ascomycete-svampen Ilyonectria crassa kan infektera potatisknölar. Detta arbete är det första som analyserar de biologiska egenskaperna och resistensen mot vissa fungicider av I. crassa-stammen isolerad från potatis. Sekvenserna av artsspecifika regioner av "potatis" -stammen sammanföll med de som erhölls tidigare för svampar som isolerats från påskliljor, ginseng, asp och bok, liljlökar och tulpanblad. Tydligen kan många vilda växter och trädgårdsväxter vara reserver av I. crassa. Den undersökta stammen infekterade tomat- och potatisskivor, men infekterade inte hela tomatfrukten och den intakta potatisknölen. Detta visar att I. crassa är en sårparasit. Utvärdering av resistens mot fludioxonil, difenokonazol och azoxystrobin på ett näringsmedium visade hög effekt av dessa läkemedel.
EC50-indikatorn (koncentrationen av fungiciden, som saktar ner med två gånger hastigheten för kolonins radiella tillväxt i förhållande till den fungicidfria kontrollen) var lika med 2; 0.4 respektive 7.4 mg / l. Möjligheten att utveckla en sjukdom orsakad av I. crassa bör beaktas vid fytopatologisk bedömning av potatisknölar och utvecklingen av växtskyddsåtgärder.
Utvecklingen av fytopatogena mikroorganismer leder till stora förluster i alla skeden av odling och lagring av potatis. När man planerar skyddsåtgärder beaktas som regel välkända patogener, såsom arter av släktet Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etc. Men under senare år har fler och fler rapporter dykt upp om nya fytopatogena mikroorganismer på potatis. Deras biologi har studerats dåligt, effektiviteten av fungicider som används på potatis i förhållande till dem är okänd, diagnostiska metoder har inte utvecklats. Med massiv utveckling kan de orsaka betydande skador på potatisgrödan. En av dessa mikroorganismer är ascomycete-svampen Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, som först upptäcktes av författarna på potatisknölar (Chudinova et al., 2019).
Detta arbete presenterar resultaten av analysen av I. crassa-stammen isolerad från potatisknölar. Morfologin för kolonier och mycelstrukturer av I. crassa, nukleotidsekvenser av artsspecifika DNA-regioner, virulens mot potatis och tomater och resistens mot vissa populära fungicider studerades.
Material och metoder
Vi använde I. crassa 18KSuPT2-stammen som isolerades 2018 från den infekterade potatisknölen som odlats i Kostroma-regionen. Knölen påverkades av en torrruttyp med ett hålrum täckt med ljusbrunt mycel. Med användning av en steril dissektionsnål överfördes svampmyceliet till en petriskål med ett agarmedium (ölvort 10%, agar 1.5%, penicillin 1000 U / ml). Plattorna inkuberades i mörkret vid 24 ° C.
Ett Leica DM2500-ljusmikroskop med en ICC50 HD-digitalkamera och ett Leica M80 binokulärt mikroskop med en IC80HD-digitalkamera (Leica Microsystems, Tyskland) användes för att fotografera, bedöma storleken och morfologin hos sporer och spororgan.
För att isolera DNA odlades svampmyceliet i flytande ärtmedium, frystes sedan i flytande kväve, homogeniserades, inkuberades i CTAB-buffert, renades med kloroform och tvättades två gånger med 2% alkohol.
DNA-extraktionsmetoden beskrivs i detalj i artikeln av Kutuzova et al. (2017).
För att bestämma arten med molekylära metoder och jämföra med andra kända I. crassa-stammar utfördes PCR med primers som möjliggjorde amplifiering av artsspecifika DNA-regioner: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5 / ITS4, White et al., 1990), genregioner b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) och translationsförlängningsfaktor la (tef1a) (primers EF1-1F / EF728-1R, Carbone och Kohn, 986). Amplikoner med önskad längd extraherades från gelén med hjälp av Evrogen CleanUp-satsen. De amplifierade regionerna sekvenserades med användning av BigDye® Terminator v1999 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) på en Applied Biosystems 3.1 xl automatiserad sequencer (Applied Biosystems, CA, USA). De resulterande nukleotidsekvenserna användes för att söka efter en matchning i GenBank-databasen från US National Center for Biotechnology Information (NCBI). Fylogenetisk analys utfördes med MEGA 3730-programmet (Tamura et al., 6).
Bestämning av virulens utfördes på hela gröna frukter av storfruktad tomat (Dubrava-sorten) och potatisknölar (Gala-sorten). För att simulera skador på skadade frukter och knölar använde vi dessutom skivor av samma frukt och knölar. Skivor av knölar placerades i fuktiga kamrar, som var petriskålar med vått filterpapper i botten. En ruta placerades på papperet, på vilken i sin tur skivor av knölar eller frukter placerades. Hela knölar och frukter placerades också i behållare med vått filterpapper i botten. I mitten av skivan (eller på den intakta ytan på knölen eller frukten) placerades en bit agar (5 × 5 mm) med svamphyfer efter 5 dagars odling på vörtagar.
Utvärdering av resistensen hos svampstammar mot fungicider utfördes under laboratorieförhållanden på agarnäringsmedium. Vi studerade känsligheten för svampdödande läkemedel Maxim, KS (aktiv ingrediens fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (Statlig katalog ..., 2020). Utvärdering utfördes i petriskålar på wort-agar-medium med tillsats av de undersökta läkemedlen vid koncentrationer av den aktiva substansen 0.1; ett; 1 ppm (mg / L) (för fludioxonil och difenokonazol), 10; tio; 1 ppm (för azoxystrobin) och i media utan fungicid (kontroll). Fungiciden sattes till det smälta och kyldes till 10 ° C medium, varefter mediet hälldes i petriskålar. Ett agarblock med svampmycelium placerades i mitten av en petriskål och odlades vid en temperatur av 100 ° C i mörkret. Efter 60 dagars inkubation mättes koloniernas diameter i två ömsesidigt vinkelräta riktningar; mätresultaten för varje koloni beräknades i genomsnitt. Experimenten utfördes i tre exemplar. Baserat på resultaten av analyserna beräknades EC24, lika med koncentrationen av fungiciden, vilket halverade koloniens radiella tillväxt i förhållande till svampdödande kontroll.
resultat och diskussion
På petriskålar med wortagar bildade svampen kolonier med vitt flockande mycel. Mediet under myceliet blev rödbrunt. När mediet torkar upp bildade svampen sporer av två typer på enkla och aggregerade konidioforer i liten sporodoki. Makrokonidier är långsträckta, cylindriska, med en till tre septor, medellängd 27.2 µm med ett intervall av värden från 23.2 till 32.2 µm, bredd - upp till 4.9 µm (fig. 1). Medellängden av mikrokonidier är 14.3 µm med ett intervall av värden från 10.3 till 18.1 µm, bredden är upp till 4.0 µm. Alla makro- och mikromorfologiska tecken passar in i variationen för arten Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Sekvenserna av artsspecifika DNA-regioner (ITS, b-tubulin, TEF 1α) sammanföll helt med sekvenserna för I. crassa-stammarna som vi studerade tidigare (Chudinova et al., 2019, tabell 1). För att studera förekomsten av I. crassa i andra regioner och analysera spektrumet av drabbade kulturer analyserades liknande DNA-sekvenser i GenBank-databasen (tabell 1). Överlappningen var 86 till 100%. Sekvenserna för alla tre DNA-regionerna av "potatis" I. crassa-stammen var identiska med sekvenserna för stammarna isolerade från liljelökan och narcissrötterna i Nederländerna och från ginsengrot i Kanada. Vi lyckades inte hitta andra I. crassastammar med tre analyserade liknande sekvenser i öppna databaser. Analys av de deponerade ITS- och b-tubulinsekvenserna visade dock närvaron av I. crassa på tulpanblad i Storbritannien. Svampar med en liknande ITS-sekvens identifierades i analysen av mykobiota av asprötter i Kanada och bokrötter i Italien, potatisknölar i Saudiarabien (Tabell 1). Resultaten av denna studie visar att I. crassa har en global distribution och kan infektera olika växtarter.
Vid bestämning av patogeniciteten på skivor tomat och potatis den 5: e dagen nådde lesionens diameter 1.5 cm. Den undersökta stammen infekterade inte hela tomatfrukten och den intakta potatisknölen. Emellertid påverkades kupblerna på tomaten. För att utesluta risken för kontaminering från myceliet som utvecklats på potatisknölskivan isolerades ett svampisolat i en ren kultur. Det var helt identiskt med föräldrastammen. Tydligen är I. crassa en sårparasit.
Behandling av fröknölar med fungicider före plantering minskar utvecklingen av sjukdomar på växter under växtsäsongen. För valet av effektiva fungicider är det viktigt att bedöma vilka av dem som är effektiva mot I. сrassa. Arbetet studerade de utbredda aktiva substanserna i fungicider - fludioxonil, azoxystrobin, difenokonazol. Fludioxonil formuleras i flera blandningar som används för att klä frön och fröknölar innan de planteras. Fludioxonil (Maxim) används också för att behandla fröknölar före lagring. Difenokonazol och azoxystrobin ingår också i ett antal preparat som används för bearbetning av utsäde, samt i beredningar avsedda för bearbetning av vegetativa växter (Statlig katalog ..., 2020).
Tillväxthastigheten för I. crassa studerades på media (fig. 2) med olika koncentrationer av aktiva substanser: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) och difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (tabell 2). Dessa preparat kan anses vara mycket effektiva mot I. crassa, eftersom deras EC50 är betydligt lägre än den rekommenderade koncentrationen av preparatet i arbetsvätskan som används för behandling av knölar. Enligt State Catalog ... (2020) är koncentrationen av fludioxonil i vätskan för behandling av potatisknölar från 500 till 1000 ppm, azoxystrobin (i vätskan för behandling av botten av furen) - 3750-9375 ppm, difenokonazol (i vätskan för behandling av vegetativa växter) - 187.5– 625 ppm.
Tabell 1. Likhet mellan sekvenser av artsspecifika sekvenser av stam 18KSuPT2 och stammar av Ilyonectria crassa tillgängliga i Genbank-databasen
Anstränga | Värdväxt, utsöndringsplats | Sekvensnummer deponerade i GenBank, procentandel av likheter | Länk | ||
DESS | β-tubulin | TEF la | |||
17KSPT1 och 18KSuPT2 | Potatisknöl, Kostroma-regionen | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, detta arbete |
CBS 158/31 | Narcissus roots, Nederländerna | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Lily bulb, Nederländerna | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginsengrot, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulpanblad, Storbritannien | KJ475469 100 | KJ513266 100 | Nd | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Asprötter, Kanada | MT294410 100 | Nd | Nd | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Bok, Italien | KR019363 99.65 | Nd | Nd | Tizzani, Haegi, Motta. Direkt inlämning |
KAUF19 | Potatisknöl, Saudiarabien | HE649390 98.3 | Nd | Nd | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = inte deponerad
Tabell 2. Resistens av Ilyonectria crassa mot fungicider
(aktiv substans) | EC50, ppm | ||||
3 dag | 5 dag | 7 dag | |||
Kontroll | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
I vårt arbete isolerades I. crassa-stammar från potatisknölar i regionerna Kostroma och Moskva (Chudinova et al., 2019). En hög andel svampstammar med ITS-sekvenser identiska med I. crassa avslöjades vid analys av mycobiota av potatisknölar i Saudiarabien (Gashgari och Gherbawy, 2013). Tydligen är I. crassa inte så sällsynt på potatis som det kan tyckas. Våra experiment visade att svampen kunde infektera skadade tomatfrukter. Det är känt från litteraturen att I. crassa kan utvecklas saprotrofiskt i jorden (Moll et al., 2016), samt infektera en mängd olika växter, även taxonomiskt avlägsna sådana som påskliljor, liljor, ginseng, asp och bok (tabell 1). ett). Tydligen kan många vilda växter och trädgårdsväxter vara reserver av I. crassa. Ovanstående visar att när man utvecklar skyddsåtgärder är det nödvändigt att ta hänsyn till möjligheten att påverka potatisknölar med denna svamp. Utbredda preparat för behandling av potatisknölar innehållande fludioxonil, azoxystrobin och difenokonazol har visat hög fungicid effekt mot I. crassa.
Detta arbete stöddes av den ryska stiftelsen för grundforskning (bidrag nr 20-016-00139).
Artikeln publicerades i tidskriften "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)